一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物细胞工程神经再修复技术领域，具体涉及一种诱导骨髓间充质干 细胞神经分化及增值的方法及装置。
【背景技术】
[0002] 神经损伤及神经退行性病变，尤其是中枢神经病变，可造成病灶区域大量神经元 凋亡或死亡，被认为是目前临床上治疗的难点。既往尝试多种办法用于治疗此类疾病，但效 果均不太理想。
[0003] 目前，细胞疗法作为一种重要的治疗方法，它的发展为神经损伤的修复带来了新 的希望。干细胞作为细胞疗法的一个重要组成部分，因其具有多向分化潜能，能被诱导分化 成神经细胞，而被越来越多的用于神经损伤的研究中。其中，骨髓间充质干细胞以其来源丰 富、易取材、分化能力强等优点受到越来越多的关注。因此，如果将骨髓间充质干细胞诱导 分化成神经细胞，那么将对神经损伤起到很好的治疗作用。
[0004] 现有技术中主要的促使干细胞向神经方向分化的方法为化学诱导法和神经营养 因子诱导法，但这些诱导方法存在一定的局限性：1)诱导液不安全，细胞毒性大。化学诱导 法是在培养基中加入适量的0 -巯基乙醇，二甲基亚砜，丁基羟基茴香醚等物质，用以影响 干细胞的分化，但这些试剂大多有强烈的细胞毒性作用，引起大量的细胞死亡。2)不易受控 制：神经营养因子在诱导分化的过程中存在半衰期短，难以在体内长期保持活性等特点，因 此该诱导方法具有一定的局限性。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种诱导骨髓间充质 干细胞分化及增值的方法及装置，该方法操作简单，过程可控性强，能够有效完成骨髓间充 质干细胞的神经分化和增值；该装置结构设计合理，容易操作，易控制。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] 本发明公开了一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)取两根导电铜丝，裁剪后用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜 固定于导电玻璃导电面的两端，固定后进行灭菌处理，备用；
[0009] 2)取新鲜离体肱骨，用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，然后将骨髓间充质干 细胞吸至15mL离心管，离心，去除上清液，加入10%FBS的DMEM/F12培养基吹打均匀，再接 种至培养瓶中，培养3~5代后备用；
[0010] 3)将步骤2)培养的细胞接种至步骤1)处理后的导电玻璃上，培养一天后，将导电 铜丝接至电刺激仪上，对细胞进行电刺激，设置电刺激参数为I. 5V/cm，频率为10Hz，然后 在37°C恒温培养箱中连续刺激7天，每天lh，通过免疫荧光染色和基因表达检测，得出细胞 向神经元方向分化结果。
[0011] 步骤2)所述的离心是在1200r/min下，处理8min。
[0012] 步骤2)所述接种至培养瓶中是按IXIO5个/瓶的浓度接种在底面积为25cm2的 培养瓶中。
[0013] 接种至培养瓶中后，置于37°C、5%CO2浓度的湿化孵箱中培养，24小时后倾去上 清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液；随后每3天换液一次，待细胞融合度达80%后，用胰 蛋白酶消化离心，按1 :2或1 :3的浓度传代，培养得到用于实验的细胞。
[0014] 步骤3)所述免疫荧光染色是检测神经元标志物MAP-2和/或P-tubulin;基因 表达是检测神经元标志物MAP-2、0 -tubulin或NF-200。
[0015] 所用导电玻璃尺寸为2. 79cmX7. 8cm。
[0016] 导电玻璃在使用前先用自来水清洗，再用去离子水清洗三遍，用吸水纸擦干后置 于烘箱中，干燥20min，取出后室温冷却5min后备用。
[0017] 本发明还公开了实现上述方法的电刺激装置，包括培养槽及铺设在培养槽中的导 电玻璃，在导电玻璃导电面的两端分别固定一根导电铜丝，两根导电铜丝的自由端与外接 的电刺激仪相连；待诱导及分化的骨髓间充质干细胞置于导电玻璃的导电面上，且培养槽 内填充培养基。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0019] 本发明公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法，采用对机体和细胞均无 害的低频交流电，采用物理刺激的方法刺激干细胞，使其能够向神经方向分化；且此种方法 易于操作，能够随时给予电刺激，具有很高的可控性；同时，本发明应用此电刺激参数（电 刺激I. 5V/cm，频率IOHz)刺激骨髓间充质干细胞不仅能够降低细胞的死亡率，同时还能增 加细胞增殖活性，所以本发明方法能够很好地应用在此类干细胞，有效解决现有神经诱导 方法对细胞及机体有害、不易控制及分化率低的问题。
[0020] 本发明公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的装置，结构设置合理，操作简 单，安全性高，可控性强。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的电刺激装置结构示意图；
[0022] 图2为骨髓间充质干细胞光镜图；
[0023] 图3为不同电刺激参数对细胞增殖活性的CCK-8吸光度值检测结果图；其中，（a) 为刺激24h; (b)为刺激48h; (c)为刺激72h;
[0024] 图4为电刺激干细胞后的神经标志物MAP-2和P-tubulin的免疫荧光检测结果 图；
[0025] 图5为本发明方法电刺激后干细胞的神经元标志物的基因表达结果图；
[0026] 其中，（a)为MAP-2 ; (b)为P-tubulin; (c)为NF200。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体的附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的 解释而不是限定。
[0028] 参见图1，本发明公开的一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的电刺激装置，包 括培养槽5及铺设在培养槽5中的导电玻璃4,在导电玻璃4导电面的两端分别固定一根导 电铜丝2,两根导电铜丝的自由端与外接的电刺激仪1相连；待诱导及分化的骨髓间充质干 细胞3置于导电玻璃4的导电面上，且培养槽5内填充培养基6。
[0029] 1、实验材料：新鲜离体肱骨，采自3-6周龄的SD大鼠，由中国人民解放军第四军医 大学实验动物中心提供。
[0030] 本发明公开的诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法，包括以下步骤：
[0031] 2、诱导骨髓间充质干细胞分化及增值的方法，包括以下步骤：
[0032] 第一步，购买并清洗导电玻璃，导电玻璃尺寸：2. 79X7. 8cm。首先用自来水清洗导 电玻璃，再用去离子水冲洗三遍，用吸水纸将其擦干后放入烤箱，烘烤20min，取出后室温冷 却5min备用。
[0033] 第二步，将清洗干净并烘干的导电玻璃至于干净桌面，取两根导电铜丝，裁剪导电 铜丝，用磨砂纸磨去铜丝两端，然后将两根导电铜丝用贴膜固定于导电玻璃导电面的两端， 包装后对其进行灭菌处理。
[0034] 第三步，提取大鼠骨髓间充质干细胞，细胞提取前对细胞室和超净台进行紫外线 照射杀菌，照射时间为2h，进细胞室前须戴无菌口罩、帽子、手术衣等。具体包括以下步骤：
[0035] 1)取新鲜离体股骨，用5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，吸至 151111离心管；将其放入离心机，设置120(^/1^11，离心81^11，弃上清；用含10%胎牛血清的 01^11/1^12培养基重悬细胞，以1\10 5个/〇112接种于25〇112培养瓶，37°(：、5%0)2、饱和湿度 条件下，培养箱培养。
[0036] 2)培养48h后半量换液，以后每2天换液1次，细胞增殖、铺满至培养瓶底接近融 合状态时，超净台内吸出培养基，加入0. 25%胰蛋白酶消化液2ml，在室温下消化约5min， 放于倒置显微镜下观察，发现细胞回缩，间隙变大时，说明细胞已经不再贴壁，将培养瓶放 进超净台，加入三倍体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，并用弯头滴管轻 柔吹打瓶壁，使其成细胞悬液，再将此悬液移至离心管中，放入离心机，以1200r/min的速 度离心8min，取出后弃上清，用含10%胎牛血清的培养液重悬，再次以同样的转速和时间 对其离心，弃上清，加入10%胎牛血清的培养基，待吹打成均匀的细胞悬液后，按1:2比例 接种于25cm2培养瓶，放入恒温培养箱内培养，每2~3d换液一次；
[0037] 3)每日于显微镜下观察细胞状态，待细胞融合达75% -80%时，需进行传代，方法 同上。3-5代细胞用于实验。第三代细胞如图2所示：细胞呈集落生长态势，细胞形态呈长 梭型或小多角形。
[0038] 第四步，将第三代细胞接种至导电玻璃上；培养一天后，将导电铜丝小心接至电刺 激仪上，首先筛选最适宜细胞的电刺激参数，设置5组电刺激参数：0V/cm，0. 5V/cm，I. 5V/ cm，3V/cm，5V/cm，频率设置为IOHz;在37度恒温培养箱中刺激，lh/d，连续刺激7天，对其 进行细胞活性检测：挑选生