专利名称：人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人骨髓间充质干细胞定向分化技术，尤其涉及一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液及其用途。
背景技术：
人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell，hMSC)属于多能干细胞，具有多向分化潜能。如何能诱导hMSC定向分化为单一的特定的细胞是目前研究的焦点，它将为组织工程和器官的替代治疗带来新的希望。目前，hMSC体外可分化为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和神经细胞等多种类型的细胞。但有关hMSC体外向表皮细胞的分化目前少有报道。我们在体外对hMSC进行了分离、培养，并成功地用我们自行配置的诱导液诱导分化hMSC为表皮样细胞。
目前关于骨髓分离骨髓间充质干细胞通常用密度梯度分离法(Pittenger M.F.et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science1999，284(5411)143-147)，使不同的细胞因密度不同而分离。取单核细胞层放入培养瓶再加培养基进行培养，每2-3天换一次培养液，7-20天后细胞可长满瓶底，然后进行传代(鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京出版社，199496)，1∶3的比例传代，一瓶细胞变为三瓶，这三瓶细胞则为第一代细胞，再传一次则为第二代细胞，到第三代细胞时，用于诱导分化。
发明内容
本发明的目的是提供一种可靠的人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液及其用途。
人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液为L-DMEM内含8-15ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.08-0.20mM氯化钙、10-50ng/ml碱性成纤维生长因子、10-50ng/ml表皮生长因子、10-50ug/ml胰岛素和5-20ug/ml维甲酸。
所述的诱导液为L-DMEM内含10ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.15mM氯化钙、10ng/ml碱性成纤维生长因子、20ng/ml表皮生长因子、10ug/ml胰岛素和8ug/ml维甲酸。
诱导液用于人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。
人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的方法步骤如下1)人骨髓间充质干细胞的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在培养基中培养，每2-3天换液，7-20天后细胞长满，消化传代；2)体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为表皮样细胞取第三代人骨髓间充质干细胞，用消化液在室温下消化，传代，然后用诱导液诱导5-30天后，人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。
所述的消化液为0.25％胰蛋白酶或0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA或EDTA(乙二胺四乙酸)。
本发明的优点1、方法简单 用我们配置的诱导液体外能诱导hMSC定向分化为表皮样细胞，方法简便，操作方便；2、来源丰富经济 骨髓可从捐献者或骨髓检查者身上获得，一般为2ml左右，需求量不大，不会对身体造成影响。
具体实施例方式
本发明的培养基为L-DMEM含胎牛血清8-15ml/100ml。诱导液为L-DMEM内含胎牛血清8-15ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.08-0.20mM氯化钙，10-50ng/ml碱性成纤维生长因子，10-50ng/ml表皮生长因子，10-50ug/ml胰岛素，5-20ug/ml维甲酸。诱导液内含胎牛血清10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子，20ng/ml表皮生长因子10ug/ml胰岛素，8ug/ml维甲酸为佳。消化液为0.25％胰蛋白酶或0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA或EDTA。
诱导液的制备方法在培养基的基础上加入100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.08-0.20mM氯化钙，10-50ng/ml碱性成纤维生长因子，10-50ng/ml表皮生长因子，10-50ug/ml胰岛素，5-20ug/ml维甲酸，混合均匀后即制得诱导液。
实施例11、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用0.25％Trypsin在室温下消化，传代，(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]8ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.08mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，10ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，5ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例21、hMSC的培养 用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞 取hMSC，用0.25％Trypsin在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]15ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.20mM氯化钙，50ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，50ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，50ug/ml胰岛素[Sigma公司]，20ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例31、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用0.25％Trypsin在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，20ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，8ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例41、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]8ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.08mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，10ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，5ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例51、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]15ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.20mM氯化钙，50ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，50ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，50ug/ml胰岛素[Sigma公司]，20ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例61、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，20ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，8ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例71、hMSC的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞取hMSC，用EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]8ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.08mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，10ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，5ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例81、hMSC的培养 用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞 取hMSC，用EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]15ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.20mM氯化钙，50ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，50ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，50ug/ml胰岛素[Sigma公司]，20ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例91、hMSC的培养 用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含10ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞 取hMSC，用EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，20ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，8ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例101、hMSC的培养 用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含8ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞 取hMSC，用EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，20ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，8ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
实施例111、hMSC的培养 用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在完全培养基(L-DMEM，内含15ml/100ml胎牛血清)里培养；2、体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞 取hMSC，用EDTA在室温下消化，传代，然后用诱导液(诱导液为L-DMEM内含胎牛血清[Gibco公司]10ml/100ml，100U/ml青霉素，80U/ml链霉素，0.15mM氯化钙，10ng/ml碱性成纤维生长因子[晶美生物公司]，20ng/ml表皮生长因子[Sigma公司]，10ug/ml胰岛素[Sigma公司]，8ug/ml维甲酸[Sigma公司])诱导7天后，hMSC分化为表皮样细胞。部分细胞由长梭形转变为扁圆形或不规则形，边界清晰，免疫组化发现诱导后的hMSCs表达CK19和P63呈阳性，pan-CK表达呈弱阳性，流式细胞仪检测发现诱导后的hMSCsP63表达呈阳性，β1-integrin阳性表达较对照组明显增强；RT-PCR和Western Blot检测到诱导后的hMSCs表达CK19和P63，β1-integrin的mRNA和相应蛋白表达较对照组明显增强。
权利要求
1.一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液，其特征在于，为L-DMEM内含8-15ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.08-0.20mM氯化钙、10-50ng/ml碱性成纤维生长因子、10-50ng/ml表皮生长因子、10-50ug/ml胰岛素和5-20ug/ml维甲酸。
2.根据权利要求1所述的一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液，其特征在于，所述的诱导液为L-DMEM内含10ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.15mM氯化钙、10ng/ml碱性成纤维生长因子、20ng/ml表皮生长因子、10ug/ml胰岛素和8ug/ml维甲酸。
3.一种如权利要求1所述的人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液的用途，其特征在于，它用于人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。
4.根据权利要求3所述的一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液的用途，其特征在于所述诱导液的人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的方法步骤如下1)人骨髓间充质干细胞的培养用密度梯度分离法分离骨髓，取单核细胞层在培养基中培养，每2-3天换液，7-20天后细胞长满，消化传代；2)体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为表皮样细胞取第三代人骨髓间充质干细胞，用消化液在室温下消化，传代，然后用诱导液诱导5-30天后，人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。
5.根据权利要求4所述的一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液的用途，其特征在于，所述的消化液为0.25％胰蛋白酶或0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA或EDTA(乙二胺四乙酸)。
全文摘要
本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液及其用途。L－DMEM内含8－15ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.08－0.20mM氯化钙、10－50ng/ml碱性成纤维生长因子、10－50ng/ml表皮生长因子、10－50ug/ml胰岛素和5－20ug/ml维甲酸。它用于人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。本发明方法简单，用我们建立的体外诱导hMSC定向分化为表皮样细胞方法简便，操作方便；来源丰富经济骨髓可从捐献者或骨髓检查者身上获得，一般为2ml左右，需求量不大，不会对身体造成影响。
文档编号C12N5/08GK1766094SQ20051006078
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者韩春茂, 王素一, 赖平平, 岑航辉 申请人:韩春茂