肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，尤其涉及肉苁蓉提取物 对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。
【背景技术】
[0002] 随着现代工业的迅猛发展，镉污染问题日益严重，大量的研究表明少量的镉（Cd) 进入人体即可通过生物放大作用和生物积累；镉是被国际公认的致癌物质之一，镉是一种 毒性很强的重金属，已被美国毒性管理委员会（ATSDR)列为第6位危害人类健康的有毒物 质。镉不仅可引起机体的急性和慢性中毒，而且对哺乳动物具有较强的致畸、致癌、致突变 作用。
[0003] 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是临床细胞 与移植治疗的重要种子细胞，同时其在生物或化学性致癌环境中的遗传稳定性及其防治措 施研究，日益成为其安全临床应用研究的热点。本课题组前期已初步研究证实，CdCl 2可诱 发BMSCs形态出现异型性，微核发生率、染色体畸变率、细胞凋亡及DNA的损伤均显著增加。 肉苁蓉归经甘、咸、温。归肾、大肠经，气微，味甜、微苦。为我国传统的名贵中药材，是补肾 壮阳处方中使用频率最高的补益药物之一。具有补肾阳，益精血，润肠通便之功效。现代药 理研究，肉苁蓉具有抗肿瘤、增强免疫能力、抗氧化的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，涉及到肉苁蓉提取物 对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用，尤其涉及肉苁蓉超滤膜提取物对化 学毒性物质氯化镉（CdCl 2)诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs)的增殖、细胞微核率和染色体 畸变率的保护作用。
[0005] 本发明提供肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用。
[0006] 作为优选，所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的 保护作用。本发明还提供肉苁蓉提取物在制备保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性 的药物中的应用。
[0007] 作为优选，所述应用为肉苁蓉提取物对镉元素诱导的骨髓间充质干细胞的增殖和 遗传稳定性的保护作用。本发明还提供肉苁蓉提取物在制备保护镉元素诱导环境下的骨髓 间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。
[0008] 作为优选，所述肉苁蓉提取物的分子量为200, 000以下。
[0009] 作为优选，所述肉苁蓉提取物的分子量为10, 000以下。
[0010] 作为优选，所述肉苁蓉提取物的浓度为0. 8g/L。
[0011] 作为优选，所述肉苁蓉提取物的制备方法为：将肉苁蓉水提，用超滤膜过滤水提 液，根据分子量要求收集截留液或透过液，干燥，得到肉苁蓉提取物。
[0012] 更优选地，所述将肉苁蓉水提是加入8倍重量的水提取1次，提取时间为1小时； 再加入6倍重量的水提取2次，每次提取1小时。
[0013] 本发明贴壁培养了小鼠 BMSCs细胞株，随机分为正常对照组、模型对照组、肉苁蓉 超滤膜提取物不同分子量段干预组，模型组与干预组以CdCl2诱导的BMSCs染毒。显微镜 下观察各组BMSCs的形态学变化，通过微核实验、染色体分析观察对BMSCs细胞微核率、染 色体畸变率的影响，并通过流式细胞仪检测肉苁蓉对CdCl 2染毒的BMSCs细胞凋亡各自的 影响。结果可见：不同分子量段的肉苁蓉超滤膜提取物均可以减小CdCl2诱导的BMSCs微 核数、微核率、染色体畸变率的发生，可以降低细胞的凋亡率；且以分子量10, 〇〇〇以下效果 最明显；与模型组相比均具有显著性差异（P〈〇. 05)。中药肉苁蓉提取物可以通过减少细胞 的凋亡来降低BMSCs的微核率和染色体畸变率，以提高BMSCs的遗传稳定性。由实验结果 可知，肉苁蓉提取物能够作为保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物使用。
【附图说明】
[0014] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0015] 图1为不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs增殖的形态观察 (10 X 10)，其中，图A为对照组，图B为模型组，图C为10, 000分子量以下肉苁蓉超滤物组， 图D为10, 000-100, 000分子量肉苁蓉超滤物组，图E为100, 000-200, 000分子量肉苁蓉超 滤物组；
[0016] 图2为肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs微核试验（40X 10);其中，图A为正常 细胞对照组BMSCs，图B为模型对照组CdCl2诱导的BMSCs，图C为10, 000分子量以下肉苁 蓉超滤物组干预后对CdCl2诱导的BMSCs ;
[0017] 图3为肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs染色体分析结果（40X 10);其中，图A 为正常细胞对照组BMSCs，图B为模型对照组CdCl2诱导的BMSCs，图C为10, 000分子量以 下肉苁蓉超滤物组干预后对CdCl2诱导的BMSCs ;
[0018] 图4为不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs凋亡率影响；其中，A为 10, 000分子量以下肉苁蓉超滤物组，B为10, 000-100, 000分子量肉苁蓉超滤超物组，C为 100, 000-200, 000分子量肉苁蓉超滤超物组，D为正常细胞对照组；E为模型对照组。
【具体实施方式】
[0019] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0020] 实施例1
[0021] 材料：小鼠 BMSCs株，由解放军兰州军区总医院骨科研究所馈赠，购自美国ATCC公 司（细胞株编号：CRL-10925)。
[0022] 实验药物：肉苁蓉提取物的制备方法如下：
[0023] (1)在肉苁蓉中加入8倍量的水，提取1小时，提取1次；之后加入6倍量的水，提 取1小时，提取2次，合并提取液。
[0024] (2)将肉苁蓉提取液用陶瓷超滤膜清洗、过滤：用0.2nm的膜管过滤，截留 液为分子量200, OOO以上的肉苁蓉；然后将透过液用0.1 nm膜管过滤，截留液为分子 量100, 000-200, 000的肉苁蓉；最后将透过液用0. 0 Inm膜管过滤，截留液为分子量 10, 000-100, 000的肉苁蓉，透过液为分子量10, 000以下的肉苁蓉。
[0025] (3)分别将分子量 10, 000 以下、10, 000-100, 000、100, 000-200, 000 的肉苁蓉超滤 膜过滤物进行蒸汽浓缩、真空干燥。取出呈干膏状的肉苁蓉，小心刮出后收集放入中药皿中 研磨呈药粉后称重装袋，装入含有干燥剂的容器中低温保存。
[0026] 实验方法：
[0027] 细胞培养及CdCl2的诱导：将小鼠 BMSCs株分别接种至含体积分数10 %胎牛血清 的DMEM/F12培养液中，分装至培养瓶中，置于37°C培养箱静置培养。每24h换液1次，待细 胞铺到瓶底80% -90%时，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化细胞，收集后吹散细胞，分装到 培养瓶中。继续培养、传代。以前期研究筛选出的CdCl2最适宜作用浓度，400 μ g/L干预小 鼠 BMSCs 24h作为CdCl2诱导BMSCs遗传损伤的细胞模型。
[0028] I MTT法检测不同浓度的肉苁蓉超滤物对BMSCs增殖的影响
[0029] 试验分为四组：
[0030] (1)模型对照组；
[0031] (2)正常细胞对照组；
[0032] (3)空白对照组；
[0033] (4)诱导组；每组各条件均设有6个复孔。
[0034] 空白对照组：只加入IOOyL完全培养液，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养 液，再加入100 μ L完全培养液。
[0035] 正常细胞对照组：将完全培养液培养的BMSCs调整密度为I X IO4个/mL，接种于96 孔板，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再加入100 μ L完全培养液。
[0036] 模型对照组：将完全培养液培养的BMSCs调整密度为I X IO4个/mL，接种于96孔 板，加入400 μ mol/L 0(1(：12后，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再加入100 μ L完 全培养液。
[0037] 诱导组：分为 10,000 以下、10, 000-100, 000、100, 000-200, 000 三个分子量段的 肉苁蓉超滤物组，每个分子量段超滤物组均设有〇. Ig/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L、I. 6g/L、 3. 2g/L的不同浓度的肉苁蓉超滤物诱导液。将完全培养液培养的BMSCs调整密度为I X IO4 个/mL，加入400 μ mol/L CdCl#，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，每孔再加入不 同浓度不同分子量段的肉苁蓉超滤物诱导液。
[0038] 以上各组分别在24h、48h、72h时取出培养板，每孔加入10 μ L的MTT溶液，0)2培 养箱中避光孵育4h，终止孵育，小心吸弃孔中培养液，每孔加入150 μ L的DMS0,摇床低速振 荡IOmin使结晶物充分溶解。同时设置调零孔、对照孔。492nm测吸光值，以该组复孔的平 均值作为该组细胞的吸光度值。实验重复三次，取平均值。取增殖最明显的最小药物浓度 为最佳浓度。
[0039] 2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl2诱导的BMSCs的干预
[0040] 将完全培养液培养的BMSCs调整密度为I X IO4个/mL，加入400 μ mol/L CdCl 2培 养24h后，随机分为：对照组（BMSCs+400 ymol/L CdCl2);分子量1万以下肉苁蓉超滤膜 提取物组（BMSCs+0. 8g/L分子量1万以下肉苁蓉超滤膜提取物+400 μ mol/L CdCl2);分子 量1-10万肉苁蓉超滤膜提取物组（BMSCs+O. 8g/L分子量1-10万以下肉苁蓉超滤膜提取物 +400 μ mol/L CdCl2);分子量10-20万肉苁蓉超滤膜提取物组（BMSCs+0.8g/L分子量10-20 万肉苁蓉超滤膜提取物+400 μ mol/L CdCl2)，每组分别加入相关药物进行干