一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甜叶菊（reAai/i/iafla Bertoni)作为一种理想的甜味剂和功能性保健产 品，已为食品和医药领域研究和开发的热点。我校甜叶菊课题组已对甜叶菊品种选育、多倍 体诱变、组培快繁、种子质量、高产栽培等进行了较为系统的研究，目前尚未见有关甜叶菊 叶片原生质体制备方面的研究报道，而甜叶菊原生质体的分离与制备是甜叶菊原生质体融 合、原生质体培养再生植株、基因的瞬时表达及蛋白的亚细胞定位等研究奠定基础。
【发明内容】
[0003] 发明目的：提供一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法。
[0004] 技术方案：本发明通过调节质壁分离时间、酶种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、 酶解液PH、酶解时间等因素，筛选出分离甜叶菊叶片原生质体最适宜的因素。其目的是这样 实现的，一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，具体包括以下实施方式： (1) 样品挑选：取甜叶菊组培苗上的幼嫩叶片； (2) 将叶片用刀片切成0. 5-1 mm的细条，置于盛有质壁分离液（CPW+13%Mannitol)的 培养皿中进行质壁分离处理； (3) 将经过质壁分离处理的叶条转移至盛有酶解液的培养皿中，于摇床上黑暗条件下 进行酶解，一段时间当酶解液中已无完整叶片细条溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜 下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体。
[0005] 根据上述方法，其特征在于，所述材料优选甜叶菊组培苗上的幼嫩叶片。
[0006] 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中酶解液的成分为CPW+Mannitol+0. 1% MES+0. 5%、纤维素酶 Onzuka R-10+0. 4%、半纤维素酶 Hemicellulase+O. 4%、离析酶 Macerozyme R_10〇
[0007] 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中酶解液中的甘露醇浓度为9%。
[0008] 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解液pH优选6.2。
[0009] 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中摇床的转速优选50rpm。
[0010] 根据上述方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解时间优选4 h。
[0011] 有益效果：本发明所述的一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，本方法简单 实用，分离材料易于获得；酶解方法简单，获得的原生质体数量多且活性高。本项技术将为 甜叶菊叶片原生质体的细胞研究、基因瞬时表达与蛋白亚细胞定位、原生质体培养和植株 再生等奠定基础。
【附图说明】
[0012] 图1甜叶菊组培苗叶片原生质体示意图； 图2同一视野在白光下FDA染色的梭梭同化枝组培甜叶菊苗叶片原生质体示意图； 图3同一视野在激发光蓝光下FDA染色的梭梭同化枝组培甜叶菊苗叶片原生质体示 意图。
【具体实施方式】
[0013] 为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施 例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
[0014] 实验材料：甜叶菊组培苗的幼嫩叶片。
[0015] 实施例中，CPW溶液的配方为：
原生质体分离： (1) 取组培甜叶菊苗上的幼嫩叶片，备用； (2) 将上述叶片用刀片切成0. 5-1 mm的细条，置于质壁分离液中质壁分离处理4h ; (3) 将经过质壁分离处理的甜叶菊叶条转移至酶解液中、温度28°C、转速为50 rpm、黑 暗条件下酶解4 h，酶解液成分为：细胞原生质体清洗液CPW+ 9%甘露醇+0. 1% MES+0. 5 % 纤维素酶Onozuka R-10+0. 4% 半纤维素酶Hemicellulase+O. 4% 离析酶Macerozyme R-10， pH 为 6. 2 ; (4) 将步骤（3)中分离得到的叶片原生质体进行检测：取10 μ L原生质体溶液加入1 yL 0. 1%的FDA染液混合均匀，用血球计数板制片后置于荧光显微镜下观察，在白光下观 察原生质体的数量，然后切换至激发光下观察视野中发绿色荧光的原生质体数量，原生质 体产量(原生质体产量=25个方格内原生质体总数/0.1 X 1000X 10个/g *FW)为1. 85 X IO7 个/g，FW，存活率为93. 37%。
[0016] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 样品筛选：取甜叶菊组培苗的幼嫩叶片； (2) 将选取的幼嫩叶片用刀片切成0. 5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液（CPW+13% Mannitol)的培养皿中进行质壁分离处理； (3) 将经过质壁分离处理的叶条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上（50rpm)黑 暗条件下进行酶解，当溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆 形的原生质体。2. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述材料为组培甜叶菊幼苗的幼嫩叶 片。3. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解液组合为 CPW+Mannitol+0.1%MES+(X5%、纤维素酶OnzukaR-10+(X4%、半纤维素酶Hemicellulase +0.4%、离析酶MacerozymeR-10。4. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中酶解液中的甘露醇浓度为 9%〇5. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解液pH为6.2。6. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中摇床的转速为50rpm。7. 根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中的酶解时间为4h。
【专利摘要】本发明涉及一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法。以甜叶菊组培苗幼嫩叶片为材料，通过控制质壁分离时间、纤维素酶Onozuka？R-10、半纤维素酶Hemicellulase、离析酶Macerozyme？R-10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离甜叶菊叶片原生质体最适合的条件。本发明所述方法获得的游离原生质体数量较多，活性较高，是一种简便、快捷制备甜叶菊叶片原生质体的方法。
【IPC分类】C12N5/04
【公开号】CN105385649
【申请号】CN201510876806
【发明人】舒英杰, 王虹, 周玉丽, 胡能兵, 何克勤, 崔广荣, 宋桂成
【申请人】安徽科技学院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月3日