本发明涉及一种糙皮侧耳原生质体的制备方法。
背景技术：
木质素是构成植物细胞壁的主要成分，是影响动物消化植物性饲料的关键所在。自腐真菌是迄今发现降解木质素最有效的微生物，也是经常用于木质素降解研究的模式菌株。但在自然状态下，由于白腐真菌的定植缓慢，很难形成优势种群，其要求的发酵条件较严格，目前大多数的研究还仅限于实验室的小试阶段。因此，白腐真菌单一菌株发酵饲料技术尚未成熟。白腐真菌通过分泌胞外氧化酶降解木质素，而白腐真菌的木质素降解酶系是一个多组分的酶系，它们分别由不同的基因控制。用目前的基因工程技术对木质素降解酶系进行转移很难奏效。虽然自20世纪80年代初以来利用质粒作载体将某些酶的基因转人大肠杆菌或酵母菌的工作逐渐增多。但是，由于现有转移系统的特定性质限制了转移外来片段的大小。因此，尚未见到采用基因转移的分子生物学方法将整个酶系统成功转入宿主的报道。
技术实现要素：
本发明提出一种糙皮侧耳原生质体的制备方法。
一种糙皮侧耳原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）取糙皮侧耳备用；
（2）取PDA培养基生长旺盛的菌丝体，接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，27℃静置培养7～13d菌丝体备用；
（3）挑取不同培养时间的菌丝体置于5 mL离心管中，用相应渗透压稳定剂洗涤，6000 r／min离心10 min，弃去清液；在2 mL离心管中，加入菌丝体，并加入1 mL酶液，每管放入2粒无菌玻璃珠，将菌丝体打散以充分接触酶液，分别在26、28、30和32℃水浴酶解一定时间，经滤网过滤，4000 r／min离心10 min，去除酶液，用相应渗稳剂洗涤后血球计数板计数，得出。
优选地，所述PDA培养基的制备方法为：
（1）取棉籽皮20％、马铃薯20％、葡萄糖2％、KH2P04 0.3％、MgS04·7H20 0.15％和维生素B．6 mg／L备用；
（2）液体培养基：葡萄糖20、酵母粉2、麦麸15、蔗糖15、KH2P04,1．5和MgS04·7H20，0.05g／L，维生素Bl，4mg／L；
（3）再生培养基：液体培养基加入0.8％琼脂和0.6mol／L不同渗稳剂。
优选地，所述渗稳剂的制备方法为：分别用去离子水将硫酸镁、氯化钾、甘露醇和蔗糖配成0.6mol／L质量浓度溶液，灭菌后备用。
优选地，所述酶液的制备方法为：渗稳剂加入酶液，溶解经滤膜，所述滤膜直径为0.22微米，过滤后备用。
本发明所述方法制备的糙皮侧耳原生质体，能促进提高动物的抗病能力，刺激其生长发育，代谢产物对饲料还具有防腐作用，可延长饲料的保质期。
具体实施方式
实施例1
一种糙皮侧耳原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）取糙皮侧耳备用；
（2）取PDA培养基生长旺盛的菌丝体，接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，27℃静置培养7～13d菌丝体备用；
（3）挑取不同培养时间的菌丝体置于5 mL离心管中，用相应渗透压稳定剂洗涤，6000 r／min离心10 min，弃去清液；在2 mL离心管中，加入菌丝体，并加入1 mL酶液，每管放入2粒无菌玻璃珠，将菌丝体打散以充分接触酶液，分别在26、28、30和32℃水浴酶解一定时间，经滤网过滤，4000 r／min离心10 min，去除酶液，用相应渗稳剂洗涤后血球计数板计数，得出。
实施例2
一种糙皮侧耳原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）取糙皮侧耳备用；
（2）取PDA培养基生长旺盛的菌丝体，接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，27℃静置培养7～13d菌丝体备用；
（3）挑取不同培养时间的菌丝体置于5 mL离心管中，用相应渗透压稳定剂洗涤，6000 r／min离心10 min，弃去清液；在2 mL离心管中，加入菌丝体，并加入1 mL酶液，每管放入2粒无菌玻璃珠，将菌丝体打散以充分接触酶液，分别在26、28、30和32℃水浴酶解一定时间，经滤网过滤，4000 r／min离心10 min，去除酶液，用相应渗稳剂洗涤后血球计数板计数，得出。
（4）所述PDA培养基的制备方法为：取棉籽皮20％、马铃薯20％、葡萄糖2％、KH2P04 0.3％、MgS04·7H20 0.15％和维生素B．6 mg／L备用；
（5）液体培养基：葡萄糖20、酵母粉2、麦麸15、蔗糖15、KH2P04,1.5和MgS04·7H20，0.05g／L，维生素Bl，4mg／L；
（6）再生培养基：液体培养基加入0.8％琼脂和0.6mol／L不同渗稳剂。
实施例3
一种糙皮侧耳原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）取糙皮侧耳备用；
（2）取PDA培养基生长旺盛的菌丝体，接种于盛有50mL液体培养基的三角瓶中，27℃静置培养7～13d菌丝体备用；
（3）挑取不同培养时间的菌丝体置于5 mL离心管中，用相应渗透压稳定剂洗涤，6000 r／min离心10 min，弃去清液；在2 mL离心管中，加入菌丝体，并加入1 mL酶液，每管放入2粒无菌玻璃珠，将菌丝体打散以充分接触酶液，分别在26、28、30和32℃水浴酶解一定时间，经滤网过滤，4000 r／min离心10 min，去除酶液，用相应渗稳剂洗涤后血球计数板计数，得出。
（4）所述渗稳剂的制备方法为：分别用去离子水将硫酸镁、氯化钾、甘露醇和蔗糖配成0.6mol／L质量浓度溶液，灭菌后备用。
（5）所述酶液的制备方法为：渗稳剂加入酶液，溶解经滤膜，所述滤膜直径为0.22微米，过滤后备用。