本发明涉及一种高大环柄菇原生质体的制备方法。
背景技术：
高大环柄菇，又名高脚环柄菇、大环柄菇、高脚小伞，隶属真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑菇科大环柄菇属，是亚热带地区的一种大型腐生食用菌，在江西省有分布。其菌体大型，食味佳，含有蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等多种营养成分，尤以人体必需的8种氨基酸含量高而著称，具有巨大的开发利用价值。东华理工大学食用菌研究中心驯化的高大环柄菇为出发菌株，对其原生质体的制备条件进行探索，以获得其原生质体制备的最佳条件，为高大环柄菇优良新品种的细胞融合选育、诱变选育和高大环柄菇优良新品种细胞工程菌株的建构奠定基础，从而促进高大环柄菇的大规模工厂化生产。
技术实现要素：
本发明提出一种高大环柄菇原生质体的制备方法。
一种高大环柄菇原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
（1）称量黄豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆浆机将其磨成豆浆，过滤后加入葡萄糖20．0g，调节总容积为10130mL(pH自然)，混合均匀，分装灭菌以备用；
（2）将固体斜面培养好的高大环柄菇菌种接种于已灭菌豆浆培养基中，在25-30℃，150-200r/min下摇床培养；
（3）待菌丝体长出来以后，取培养一定时间的菌丝培养液5mL于无菌离心管中，用灭菌的渗透压稳渗荆洗涤，在800r/min离心，弃去上清液收集菌体，再加入1mL相应的酶解液，置一定温度下恒温培养，隔时摇动，并用无菌吸管猛吸多次，促使原生质体从残余菌丝上释放，间隔一定时间取样在10x40倍的光学显微镜下用血球计数板计算原生质体产出量；
（4）在3000-3500r/min离心10min弃去酶液上清液，用渗透压稳渗洗涤2次即获得纯化原生质体。
优选地，所述步骤（2）培养环境为28℃，180r/min。
优选地，所述步骤（4）在3200r/min离心。
本发明所述方法制备的高大环柄菇原生质体，原生质体产出量高，可充分发挥酶的效力，本发明工艺简单，使用实用性强，可工业化生产。
具体实施方式
实施例1。
一种高大环柄菇原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
（5）称量黄豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆浆机将其磨成豆浆，过滤后加入葡萄糖20．0g，调节总容积为10130mL(pH自然)，混合均匀，分装灭菌以备用；
（6）将固体斜面培养好的高大环柄菇菌种接种于已灭菌豆浆培养基中，在25-30℃，150-200r/min下摇床培养；
（7）待菌丝体长出来以后，取培养一定时间的菌丝培养液5mL于无菌离心管中，用灭菌的渗透压稳渗荆洗涤，在800r/min离心，弃去上清液收集菌体，再加入1mL相应的酶解液，置一定温度下恒温培养，隔时摇动，并用无菌吸管猛吸多次，促使原生质体从残余菌丝上释放，间隔一定时间取样在10x40倍的光学显微镜下用血球计数板计算原生质体产出量；
（8）在3000-3500r/min离心10min弃去酶液上清液，用渗透压稳渗洗涤2次即获得纯化原生质体。
优选地，所述步骤（2）培养环境为28℃，180r/min。
实施例2。
一种高大环柄菇原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
（9）称量黄豆12．5g，在水中浸泡10-15h后用豆浆机将其磨成豆浆，过滤后加入葡萄糖20．0g，调节总容积为10130mL(pH自然)，混合均匀，分装灭菌以备用；
（10）将固体斜面培养好的高大环柄菇菌种接种于已灭菌豆浆培养基中，在25-30℃，150-200r/min下摇床培养；
（11）待菌丝体长出来以后，取培养一定时间的菌丝培养液5mL于无菌离心管中，用灭菌的渗透压稳渗荆洗涤，在800r/min离心，弃去上清液收集菌体，再加入1mL相应的酶解液，置一定温度下恒温培养，隔时摇动，并用无菌吸管猛吸多次，促使原生质体从残余菌丝上释放，间隔一定时间取样在10x40倍的光学显微镜下用血球计数板计算原生质体产出量；
（12）在3000-3500r/min离心10min弃去酶液上清液，用渗透压稳渗洗涤2次即获得纯化原生质体；
（13）所述步骤（2）培养环境为28℃，180r/min；
所述步骤（4）在3200r/min离心。