一种菌核青霉及其应用的制作方法

本发明属于微生物新品种及发酵工艺领域，具体涉及一种菌核青霉及其应用。

背景技术：

菌核青霉属于青霉属。为分布很广的子囊菌纲中的一属，其菌落在CA上25℃培养12天，直径25-30mm，有的分离物可达45mm，放射状皱纹较多或较少；质地绒状或带絮状，因菌核较多而兼颗粒状；分生孢子结构有限或局部较多，分生孢子面蓝绿色或暗灰绿色，近于豆绿色、暗常春藤绿色或淡灰橄榄色；菌丝体往往有白色变为橘红或橙黄色；渗出液较多，带红色，也有的分离物缺乏；反面暗红，褐红或橘红色；可溶性色素类似较淡的反面颜色，偶有缺乏者。

咖啡碱是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。我国是咖啡碱生产和消费大国,咖啡碱及N-甲基黄嘌呤常用作食品和药品。通过微生物/酶法生产或降解相关N-甲基黄嘌呤,获得高附加值产物,在医药卫生领域具有广阔的应用前景。目前,咖啡碱可降解菌株的种类较少。筛选高效咖啡碱降解菌株并克隆其相关基因,将为开发微生物降解咖啡碱技术,解决相关领域因应用咖啡碱带来的日益严重的环境与健康问题,奠定基础。

绿茶中咖啡碱含量高是长期以来众所周知的问题，用现有方法降低其咖啡碱会导致绿茶的风味和口感发生巨大的改变，使其不再是绿茶，而且会破坏绿茶中的其他成分。

酯型儿茶素亦称“复杂儿茶索”。一类茶儿茶素。主要有EGCG和ECG。其分子结构中比简单儿茶索多结合1～2个没食子酰基。含量占儿茶素总量的60％～75％，茶叶干重的12％～15％。具有较强的苦涩味和收敛性，是茶汤的主体呈味成分。易被氧化，在呼吸代谢中是氢的中间传递体。表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，是茶多酚生物活性的主要成份。

单宁酶(Tannase,EC3.1.1.20)，又叫单宁酰基水解酶(Tannin Acyl Hydrolase)，属于诱导酶，可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸。是酶解转溶“茶乳酪”的专一酶类，近年来伴随着茶饮料的迅猛发展而得到深入的研究(苏二正等，2004)。单宁酶主要由丝状真菌产生，如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillvium)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)等均可产单宁酶，某些酵母和细菌也可以生产单宁酶(谷文等，2010)。

单宁酶在食品、啤酒、葡萄酒、饲料加工和精细化工等行业都有着广泛的应用。美国食品与药物管理局已确定单宁酶为安全产品，在日本单宁酶已通过FAD批准应用。另外，单宁酶可将五倍子单宁降解为没食子酸(gallic acid，GA)，而后者是一种重要的化工原料，应用范围很广，用量大，现己成为市场畅销产品。通过单宁酶水解单宁生产GA，与化学方法相比具有产率高、反应条件温和、生成的污染物少等优点，符合绿色化工生产的要求(杨亚力等，2002)。

虽然单宁酶的用途广泛，但是由于生产提纯过程复杂，产量很小所以市场价格昂贵，这样就使单宁酶的应用受到限制。单宁酶属于诱导酶，主要是利用微生物发酵进行生产，国内外研究的焦点集中在对产单宁酶的菌株筛选和诱变改良上，从富含单宁的环境样品中进行产单宁酶菌株的分离筛选，如茶园土壤、皮革厂废水、五倍子及其他富含单宁的植物等，目前直接从茶树中分离可产单宁酶的内生真菌鲜有报道。本发明提出了一种产单宁酶的茶树内生真菌，以丰富对产单宁酶微生物的认识，为单宁酶的开发利用提供一些新思路。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种菌核青霉菌株及其应用，该菌株具有降解咖啡碱、水解表没食子儿茶素没食子酸酯和产生单宁酶的特点，可用于制备低咖啡碱、弱苦涩味的新型茶饮料，该菌株已于2016年10月8日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该菌核青霉菌株的保藏号为：CCTCC No:M2016543，拉丁名：Penicilliumsclerotiorum,地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。

本发明保藏的菌核青霉菌落的特征为：菌落灰绿色，表面无色菌丝呈绒毛状，菌落背面先无色后呈黄色，菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗形如扫帚，称为帚状体。在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子球形，呈绿色。

所述菌核青霉属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，不整囊菌纲Eurotiomycetes，曲霉目Eurotiales，发菌科Trichocomaceae，青霉属Penicillium。

本发明还提供了所述菌核青霉菌株的几个新用途。

首先，所述菌核青霉菌株用于降解绿茶滤液中的咖啡碱。

其中，所述降解绿茶滤液中的咖啡碱的方法为：将绿茶干燥后在沸水中浸泡30～60min；浸泡结束后，立即趁热过滤，得到绿茶滤液；在绿茶滤液中加入蔗糖或葡萄糖，高温灭菌，灭菌结束后，得到绿茶茶汤；活化本发明保藏的菌核青霉，配制菌核青霉菌悬液；将绿茶茶汤中接入菌核青霉菌悬液，在温度28±5℃的条件下有氧培养1～10天，得到发酵后的绿茶茶汤；将发酵后的绿茶茶汤灭菌，过滤，去除沉淀物及菌体，绿茶滤液中的咖啡碱含量显著降低。

其次，所述菌核青霉菌株用于水解绿茶滤液中的表没食子儿茶素没食子酸酯。

再次，所述菌核青霉菌株用于制备单宁酶。

最后，所述菌核青霉菌株用于制备低咖啡碱、所述菌核青霉菌株用于制备低咖啡碱、弱苦涩味的绿茶饮料原浆。

有益效果

其一，本发明分离出的菌核青霉与传统的菌核青霉比有一些特有的特性。首先，本发明保藏的菌核青霉能够显著降低绿茶滤液中咖啡碱的含量，由于绿茶中含有大量的咖啡碱，不利于广大中老年人饮用，会使其中枢神经兴奋，破坏生物钟的平衡，而采用本发明保藏的菌核青霉发酵后的绿茶滤液的咖啡碱含量会显著降低，根据检测的实验数据，经过发酵后，绿茶滤液中的咖啡碱含量由开始的0.205±0.001mg/mL降低到0.027±0.015mg/mL，可见，本发明的菌核青霉对咖啡碱(CAF)的降解能力很强，咖啡碱降解率达到87.94％。发明人尚未查询到相关报道。

其二，采用本发明的菌核青霉发酵绿茶茶汤，在发酵过程中，绿茶茶汤内苦涩味较强的表没食子儿茶素没食子酸酯等酯型儿茶素被水解为苦涩味较弱的非酯型儿茶素，其中表没食子儿茶素没食子酸酯含量由发酵前的0.192±0.006mg/mL降低到0.013±0.015mg/mL，显著降低，最终可以制备出酯型儿茶素含量低、非酯型儿茶素含量高、咖啡碱含量低的绿茶饮料，同时发酵过程对绿茶茶汤中的其他物质改变不大，保留了原有绿茶中的其他有效成分和风味物质。

其三，本发明的菌核青霉能够很好的适应各种发酵环境，发酵状态控制性高，不产生有毒有害物质，能保证发酵后产品的安全性，同时，还能够降低绿茶饮料中的苦涩味，为茶饮料的生产提供新的思路。同时，本发明菌株的发酵工艺简单，发酵成本低，适合于工业化大规模生产。

附图说明：

图1为本发明菌核青霉在PDA培养基上的菌落形态图。

图2为本发明菌核青霉在显微镜下的形态图。

图3为经过本发明菌核青霉发酵前后的绿茶茶汤的HPLC检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。

实施例1

一种菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该菌核青霉菌株的保藏号为：CCTCC No:M2016543。

其中，本发明实施例所用的其他试剂均为分析纯。

以下结合实例对本发明进行详细说明

本发明保藏的菌核青霉菌株是从农抗早品种的茶树叶片中分离得到的。具体分离步骤为：

1)将茶树叶片先用无菌水冲洗，再用70％的乙醇浸泡1min，然后用3.5％的次氯酸钠浸泡4min，再用70％乙醇浸泡30s，最后用无菌水洗净叶片。

2)用无菌解剖刀将叶片按左右对称的方向切取切成约5mm×5mm大小的组织块，然后分别放置于PDA培养基上，每个培养皿放入4-6个组织块，28℃恒温培养至小块周围长出菌落。

3)挑取长势较好的菌落接种于PDA固体培养基，纯化，保存。

其中，所述PDA培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖25g，琼脂16g，制备方法如下：马铃薯去皮，切块煮沸20min，用纱布过滤，加入蔗糖和琼脂，补水至1000ml，在121℃灭菌15min，得到PDA培养基。

本发明保藏的菌核青霉菌落的特征为：菌落灰绿色，表面无色菌丝呈绒毛状，菌落背面先无色后呈黄色，菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗形如扫帚，称为帚状体。在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子球形，呈绿色，其在PDA培养基上的菌落形态见图1，电子显微镜下的形态见图2。

为测定本发明分离的菌核青霉能够降解咖啡碱、水解表没食子儿茶素没食子酸酯，同时该菌株能够生产单宁酶，通过固体发酵培养能够在短时间内获得大量单宁酶，其具体测定方法如下：

将绿茶茶汤中接入1.0×10⁸CFU/mL本发明保藏的菌核青霉的菌悬液，接种量为1％，对照组接入同等量的灭菌水。然后在温度28℃、转速150r/min的条件下进行培养，每隔24小时去一次样，取出的样品用0.45μm滤膜过滤后，采用HPLC的方法对其进行茶汤主要8种成分的分析。

咖啡碱和表没食子儿茶素没食子酸酯采用上海伍丰科学仪器有限公司的C-100高效液相色谱仪进行定性定量分析，分析色谱柱采用美国Phenomenex公司的C18分析色谱柱，其规格为5μm，250mm×4.6mm；咖啡碱和表没食子儿茶素没食子酸酯标品来自上海源叶生物科技有限公司。

测定所用的HPLC的色谱条件为：流动相A为0.15％乙酸，流动相B为乙腈，流动相流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，进样量20μL，梯度洗脱。流动相梯度见下表。

表1流动相梯度

HPLC测定的结果如图3所示，其中，上图为本发明菌核青霉发酵前绿茶茶汤的HPLC检测图；下图为本发明菌核青霉发酵后绿茶茶汤的HPLC检测图。通过HPLC的数据分析，可以得出在本发明的菌核青霉发酵过程中茶汤内的表没食子儿茶素没食子酸的含量逐渐降低，第3天时，表没食子儿茶素没食子酸差不多完全水解。本发明保藏的菌核青霉对咖啡碱的降解能力很强，经过菌核青霉发酵后，咖啡碱降解率达到86.83％。

表2本发明菌核青霉发酵茶汤成分含量对比

其中，所述的GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、GCG和ECG分别是没食子酸，表没食子儿茶素，咖啡碱，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯，没食子儿茶素没食子酸酯，表儿茶素没食子酸酯，由上表的数据可以看出，其咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯有显著下降，而其他的非酯型儿茶素含量均有上升，这就意味着，绿茶中的主要苦涩味酯型儿茶素转变成成弱苦味无涩味的非酯型儿茶素，在降低绿茶苦涩味的同时，不降低绿茶中儿茶素的营养价值，是不可多得的特性。本发明保藏的菌核青霉不仅没有改变绿茶中的营养成分，而且改善了绿茶的风味，有很强的实用性。

申请人对此菌核青霉进行了毒理学实验，设定的小鼠实验环境条件为温度范围22-27℃，相对湿度范围40-70％。实验动物在进行实验前先在动物房环境中适应3天，3天后，去除身体状况不合格的实验小鼠，称重编号，随机分组，每组10只，雌雄各半，在实验过程中雌雄鼠分开喂养，并保持一定的距离，防止外在的因素影响最终的实验数据。实验前，隔夜禁食，不限制饮水。实验组按照设定的给药剂量每只实验小鼠按照体重来计算，每次灌胃0.5mL/30g，对照组实验小鼠按照体重来按实验组的计算方法灌生理盐水。实验小鼠在准备灌胃前需要禁食12h，但是不限制其饮水，灌胃结束后可给实验小鼠提供适量的食物。连续灌胃7天。灌胃后随时观察小鼠的活动状况、死亡情况和中毒症状，每天都要对实验小鼠的体重及饮食状况进行记录。

菌核青霉茶汤发酵液的急性毒性试验结果表明，小鼠在实验过程中未见明显的中毒性病变。实验小鼠在给药7天内，各实验组小鼠外观行为、饮食情况、粪便等方面无异常，各实验组小鼠无死亡现象。将得到的实验数据通过统计学SAS软件进行分析，实验结果表明各实验组小鼠的肾脏、肝脏和脾脏的实验数值以及血生化指标与对照组小鼠的实验数值比较都没有显著性差异，实验小鼠的肾脏、肝脏和脾脏等器官的大小正常、外观颜色也正常，没有出现明显的水肿、萎缩等病理性变化。按急性毒性分级，本发明菌株发酵出的茶汤属于实际无毒级。

实施例2

一种菌核青霉在制备茶饮料中降低咖啡碱、水解表没食子儿茶素没食子酸酯的应用，具体如下：

1)精确称取6.000g磨碎的绿茶样品放入500mL的锥形瓶中，加入200～400mL的沸水，在沸水浴中浸提45min。

2)浸提完成后，立即趁热减压过滤，得到绿茶滤液。

3)绿茶滤液冷却后将其转移到1L容量瓶中，并用蒸馏水定容至1L。

4)在每升茶汤中加入5g蔗糖，包扎好并于121℃下灭菌20min，灭菌结束后，得到绿茶茶汤。

5)取本发明保藏的菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该菌核青霉菌株的保藏号为：CCTCC No:M2016543，置于PDA培养基中活化，得到活化的菌核青霉，并将其配制成5.0×10⁷CFU/mL的菌核青霉菌悬液。

6)将绿茶茶汤中接入5.0×10⁷CFU/mL的菌核青霉菌悬液，接种量为1％，在温度28℃、转速150r/min的条件下进行培养1～10天，得到发酵后的绿茶茶汤。

7)将发酵后的绿茶茶汤采用UHT灭菌法灭菌，用0.45μm滤膜过滤，去除沉淀物及菌体后，得到一种全新的低咖啡碱、弱苦涩味的绿茶饮料原浆。

所述绿茶饮料原浆中，咖啡碱含量小于0.027±0.015mg/mL,表没食子儿茶素没食子酸酯含量小于0.013±0.015mg/mL，较之于传统绿茶饮料有显著下降。

实施例3

一种菌核青霉在制备茶饮料中的应用，具体如下：

1)将新鲜采摘的绿茶干燥后加入沸水，在沸水中浸提30～60min。

2)浸泡结束后，立即趁热过滤，得到绿茶滤液。

3)在绿茶滤液中加入蔗糖或葡萄糖，高温灭菌，灭菌结束后，得到绿茶茶汤。

4)取本发明保藏的菌核青霉菌株，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该菌核青霉菌株的保藏号为：CCTCC No:M2016543，置于PDA培养基中活化，得到活化的菌核青霉，并将其配制成1.0×10⁶～1.0×10⁸CFU/mL菌核青霉菌悬液。

5)将绿茶茶汤中接入菌核青霉菌悬液，接种量为1～10％，在温度28±5℃的条件下有氧培养1～10天，得到发酵后的绿茶茶汤。

6)将发酵后的绿茶茶汤采用UHT灭菌法灭菌，用0.45～0.60μm滤膜过滤，去除沉淀物及菌体后，得到一种全新的低咖啡碱、弱苦涩味的绿茶饮料原浆，所述绿茶饮料原浆的咖啡碱含量为0.027±0.015mg/mL。

实施例4

本发明分离的菌核青霉还可以生产单宁酶，具体包括以下步骤：

1)菌株的活化及孢子悬浮液的制备：将本发明保藏的菌核青霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在30℃下培养4d，所述菌株已于2016年10月8日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该菌核青霉菌株的保藏号为：CCTCC No:M2016543，制备单孢子悬浮液，制备好的孢子菌悬液在4℃同步培养1h备用接种。

2)固态发酵产单宁酶：将上述孢子悬浮液以0.2ml/g的比例接种到产酶培养基上，28℃，培养4d。

3)取出接种后发酵了4d的培养基，在盛有培养基的三角瓶中加入pH 5.0的柠檬酸缓冲液，在28℃条件下、180r/min震荡30min，震荡后的培养基用定性滤纸过滤，收集滤液即得粗酶液。

4)酶液的脱色、除菌：4℃下，用1％(w/v)的活性炭对粗酶液进行脱色处理30min，过滤后再用0.22μm的滤膜除菌。

5)单宁酶粉的制备：向上述脱色、除菌后的酶液中先后加入50％、90％饱和度的硫酸铵沉淀单宁酶，溶解后透析除盐，冷冻干燥后得到高纯度的单宁酶粉。

本发明测定菌核青霉的单宁酶生产能力的方法：配置0.1g/ml的单宁酸溶液，在无菌条件下用移液枪吸取1ml单宁酸溶液加入马丁氏培养基平板表面涂布均匀，吸出多余单宁酸溶液。挑取少量菌丝接种在培养基上，28℃下培养2～3天，观察各个菌株生长状况。若菌落周围出现透明水解圈则说明该菌具有产单宁酶的能力。

测定菌核青霉生产单宁酶的方法：

1)发酵培养：用无菌水洗下PDA培养基上的孢子，制成孢子浓度为1.0×10⁸个/ml的单孢子悬浮液，再以0.2ml/g的比例接种到产酶培养基上，28℃，培养4d。

2)单宁酶的提取：取出培养4d的锥形瓶，在锥形瓶中加入40mL pH5.0的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，30℃条件下160r/min振荡浸提1h，用定性滤纸过滤得粗酶液。粗酶液3500r/min转速下离心20min去除固形物。取上清液加入(NH4)₂SO₄粉末至饱和度40％，搅拌均匀，静置3h，3500r/min转速下离心10min，取上清加(NH4)₂SO₄粉末至饱和度90％，搅拌均匀，4℃的条件下静置过夜，3500r/min转速下离心20min，弃上清液，沉淀用等体积的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液溶解，放入透析袋中透析至氯化钡检测不到硫酸根离子，再冷冻干燥得到粗酶粉。

3)酶活性检测：将单宁酶在pH5.0，30℃条件下每分钟水解1μmolEGCG所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。取两只洁净试管，分为对照管和测试管。所有试管都加入0.25mlEGCG溶液，30℃预热5min，测试管加入酶液0.25ml，对照管加入煮沸失活的酶液0.25ml，反应十分钟后煮沸十分钟，0.45μm滤膜过滤后液相检测EGCG的含量。

检测结果显示，采用本发明保藏的菌核青霉制备出来的单宁酶具有产量高，活性高的特点。