一种低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及功能性食品添加剂的技术领域，具体涉及一种低分子量蝙蝠蛾拟青霉低胞外多糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)和中华被毛抱(Hirsutella sinensis)是天然冬虫夏草中两种重要的内生真菌，研宄表明两者共同参与了天然冬虫夏草的生长分化，其中化学组成分析表明蝙蝠蛾拟青霉的化学指纹图谱与天然冬虫夏草更为接近，也含有天然冬虫夏草中所具有的虫草素、甘露醇、虫草多糖、生物碱类等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、调节机体免疫能力等多种生物功能。
[0003]多糖类作为冬虫夏草所含的生理活性物质中含量最高、功能最丰富的类群之一，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种生理功能，是冬虫夏草开发研宄的一个重要突破口，具有良好的应用前景。由于天然冬虫夏草价格昂贵，虫草多糖可从天然虫草中分离出的相关无性型菌株的发酵获得，可分别从它们的菌丝体和发酵液中分离得到胞内多糖和胞外多糖。
[0004]近年来，随着蝙蝠蛾拟青霉(P.hepiali)、中华被毛孢(H.sinensis)、中华弯颈曲霉(Tolypocladium sp.)、蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepiali)等冬虫夏草无性型菌株研宄的深入，采用这些菌株进行液体发酵生产冬虫夏草中替代活性物质称为研宄的热点。其中，蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)作为虫草无性型的一种，是天然冬虫夏草分化成熟过程中的一种重要内生真菌，其发酵产物与天然冬虫夏草成分非常接近。本研宄中所用菌株于2002年分离自青海省玉树地区的天然虫草子实体中，并由中科院菌种保藏中心鉴定。由于虫草分布的广泛性和无性型菌株的多样性，不同科研机构对无性型虫草的研宄有很大差异，而关于利用该菌株液体发酵并从发酵液中分离获得低分子量胞外多糖的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的旨在提供一种制备低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的方法，实现本发明的具体方案如下:
[0006](I)从保存于土豆斜面培养基上的母种中挖取菌丝体块(大小为0.5cmX0.5cm)，接种于种子培养基中(每只250mL三角瓶装种子培养基10mL)，于20°C下静止培养12小时后，120转/分钟下振荡培养培养72小时，S卩可获得种子液。种子培养基(g/L):葡萄糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氢钾1.50，硫酸镁0.50，麦芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5。
[0007](2)取步骤(I)中的种子液接种到发酵培养基中(每只500mL三角瓶装发酵培养基200mL)，接种量为2% (V/V)，于20°C下静止培养12小时后，然后在120rpm下振荡培养培养48小时后，在无菌条件下，按发酵液体积的1.0%加入吐温80，再继续培养96小时后，将发酵产物于4000转/分钟条件下离心15分钟获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液。发酵培养基配方(g/L):甘露糖50，酵母膏1.50g/L，硫酸铵5.00g/L,磷酸二氢钾1.50g/L，硫酸镁0.05g/L，土豆汁 15.00g/L，麦芽汁 15.00g/L，pH 6.5 ；
[0008](3)将步骤(2)中获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株发酵液分别于超滤系统下先后经过0.1 μπι和截留分子量大小为100kD、50kD、10kD和3kD的超滤膜组件，将3kD超滤膜组件的截留液减压浓缩至原体积的1/3，加4倍体积的无水乙醇，沉淀12小时后，用90%乙醇洗涤3次后，在5000转/分钟条件下离心15分钟收集沉淀即可获得低分子量胞外粗多糖；
[0009](4)将步骤(3)制得的低分子量胞外多糖通风挥去乙醇，加少量去离子水复溶后，用氯仿和正丁醇体积比为4: I的混合溶液脱蛋白3次后，将水相溶液冷冻干燥即可获得低分子量胞外多糖冷冻干粉；
[0010](5)将步骤(4)所得低分子量胞外多糖用分子排阻色谱检测其分子量分布情况，用红外光谱分析特征基团组成，用紫外光谱扫描确定其是否具有蛋白质组分。
[0011]2、根据专利要求I所述的一种具有生物活性胞外酸性糖蛋白的制备方法，其特征在于:
[0012](I)所述步骤(2)的发酵培养基配方:甘露糖50g/L，酵母膏1.50g/L，硫酸铵
5.00g/L，磷酸二氢钾 1.50g/L，硫酸镁 0.05g/L，土豆汁 15.00g/L，麦芽汁 15.00g/L，pH
6.5 ；
[0013](2)所得到的低分子量胞外多糖的分子量范围为3000-10000道尔顿，单糖组成为甘露糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=53.62: 3.20: 3.51: 13.10: 14.17: 2.24。
[0014]制备的低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外胞外多糖为灰白色疏松粉末，其中多糖含量86.72%，蛋白含量12.58%，容易吸潮。该低分子量胞外多糖的红外吸收光谱表明其具有多糖、羧基、硫酸基和氨基的特征吸收峰。该低分子量胞外多糖的紫外吸收扫描表明其含有蛋白的吸收峰。对该低分子量胞外多糖的分子量进行测定，表明其分子量分布在3000-10000道尔顿之间。
【附图说明】
[0015]图1不同碳源发酵对低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖分子量组成的影响
[0016]图2不同添加剂对低分子量胞外多糖产量的影响
[0017]图3低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的红外吸收图谱
[0018]图4低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的单糖组成分析
[0019]图5低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的分子量分布
[0020]图6低分子量蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的扫描电镜图
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
[0022]实施例1:
[0023](I)从保存于土豆斜面培养基上的母种中挖取出菌丝体块(大小为0.5cmX0.5cm)，接种于种子培养基中(每只250mL三角瓶装种子培养基10mL)，于207°C下静止培养12小时后，120rpm下振荡培养培养72小时，即可获得种子液。种子培养基(g/L):葡萄糖糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氢钾1.50，硫酸镁0.50，麦芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5，ο
[0024](2)取步骤(I)中的种子液接种于装有200mL发酵培养基的容量为500mL的三角瓶中，按发酵培养基体积的2%接入种子液，于20°C下静止培养12小时后，然后在120rpm下振荡培养培养48小时后，在无菌条件下，按发酵液体积的1.0%加入吐温80，再继续培养96小时后，将发酵产物于4000转/分钟条件下离心15分钟后，收集上清液即为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株发酵液。发酵培养基配方为:甘露糖50g/L，酵母膏1.50g/L，硫酸铵5.00g/L，磷酸二氢钾1.50g/L，硫酸镁0.05g/L，土豆汁15.00g/L，麦芽汁15.00g/L，pH 6.5 ；
[0025](3)将步骤(2)中获得的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株发酵液分别于超滤系统下先后经过0.1 μπι和截留分子量大小为100kD、50kD、10kD和3kD的超滤膜组件，将3kD超滤膜组件的截留液减压浓缩至原体积的1/2，加4倍体积的无水乙醇，沉淀12小时，用90%乙醇洗涤3次后，