一种高产蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株及培育方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明涉及到一种高产蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供 了该菌株的培育方法，属于发酵工程技术领域。
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【背景技术】： 蝙蝠蛾拟青霉为天然冬虫夏草中分离到的内寄生菌，是天然冬虫夏草中普遍存在的一 种虫草的无性型，该菌经深层发酵所得的菌丝体与天然冬虫夏草化学成分对比研宄表明， 两者主要成分、药理作用基本相似，为天然冬虫夏草有效成分和功效的替代品。另外，该菌 已经被列入"可用于保健品的真菌菌种名单"。蝙蝠蛾拟青霉菌丝体以其经济实惠、品质优 良、使用方便开启了虫草应用的新局面。
[0003]
【发明内容】
： 本发明的目的是提供一株蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，为一种新的菌株，其菌丝体干重及 有效成分腺苷、多糖和虫草酸的产量和原始菌株相比具有显著提高。
[0004] 本发明公开的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，命名为：蝙蝠蛾拟青霉PH4tl (命名为： cAe/7 PH40)，该诱变菌株已于2014年12月26日保藏《中国典型培 养物保藏中心》，保藏号为：CCTCC NO :M 2014670,根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树 表明，菌株属于蝙蝠蛾拟青霉。
[0005] 本发明所述的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，其有以下方法诱变选育而制得，以蝙蝠蛾 拟青霉(购买自安徽农业大学微生物保存中心RCEF1429)为出发菌株，采用化学诱变处理技 术，选育出高产的蝙蝠蛾拟青霉高产突变菌株PH 4(i。
[0006] 本发明所述的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株的特征为：菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多 糖的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高了 44.06 %，腺苷含量提高了 3. 59%，甘露醇含量提高了 104. 7%，多糖含量提高了 139.83%。
[0007] 采用本发明所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株进行液体深层发酵的方法，包括以下步骤 完成： (1) 一级斜面菌种： 斜面培养基：土豆 200 g/L，葡萄糖 18-22 g/L，KH2PO4 0. 1-0. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 5 g/L，琼脂 18-25 g/L。
[0008] 斜面菌种培养温度26 ± I °C，4-5天菌丝长满斜面，放冰箱（2-4°C )保存备用。
[0009] (2)二级摇瓶菌种 种子培养基：葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8-12 g/L，KH2PO4 0.1-0. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 5 g/L，维生素 B1 0· 05-0.1 g/L。
[0010] 种子培养方法：将斜面母种接入液体种子培养基，在26±1°C，120-160 r/min的 摇床培养4d。
[0011] (3)摇瓶发酵培养 将种子液按5%接种量接入液体发酵培养基(蔗糖：26-32 g/L，酵母浸粉：15-20g/L，蛋 白胨：8-12g/L，（NH4)2S04:8-12 g/L，KH2P04:2-4 g/L，MgS04:2-4 8/1，￥81:0.1-0.38/1，氯 化锌：0. 01-0. 02g/L)中进行液体发酵，发酵培养基装液量为250mL的摇瓶装100mL，培养温 度26°C，摇床转速为150rpm，培养4d后收获菌丝体。
[0012] (4) 100L发酵罐放大培养 将种子液按5 %接种量接入60L液体发酵培养基中，于100L发酵罐中进行液体深层 发酵培养，26°C，200 r/min，通气量4 L/min，初始pH为5. 0,培养72 h。
[0013] 本发明的积极效果在于：提供了的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株（PH4tl)为一种新菌株， 菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高 了 44. 06 %，腺苷含量提高了 3. 59%，甘露醇含量提高了 104. 7%，多糖含量提高了 139. 83%。 该蝙蝠蛾拟青霉诱变株PH4tl菌丝生长快速，菌丝体初期为棕色，后期逐渐变为棕黄色，可进 行快速液体深层培养。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1 蝙蝠蛾拟青霉PH4tl的诱变选育方法 本发明所述的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株的诱变方法为亚硝基胍诱变。
[0015] 1)将蝙蝠蛾拟青霉菌株，划线接种于斜面培养基中，26°C培养箱培养5天，菌丝 体为白色，向斜面中注入无菌生理盐水，震荡后，采用9层纱布过滤，稀释至浓度为IO 6个/ ml的孢子悬液，采用10ug/ml的无菌亚硝基胍溶液处理30min后，取孢子悬液采用无菌生理 盐水逐级稀释，涂布至种子培养基平板中培养7天后，挑去单菌落于96孔板中保存。
[0016] 2)采用无菌接种针逐个挑去诱变菌株至种子培养基中进行活化，于26°C恒温摇床 中150rpm培养5天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和虫草酸含量，以筛选高产突变株。采用 HPLC法测定菌丝体中腺苷含量；采用蒽铜一硫酸法测定总糖含量；采用DNS方法测定单糖 含量；利用分光光度法测定虫草酸含量。
[0017] 所述的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，命名为：蝙蝠蛾拟青霉PH40 (paecilomyces hepiali chen&dai，PH4(I)，该诱变菌株已于2014年12月26日保藏《中国典型培养物保藏 中心》，保藏号为：CCTCC M 2014670,根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属 于蝙蝠蛾拟青霉。
[0018] 实施例2 蝙蝠蛾拟青霉诱变株（PH4tl)与出发菌株比较及遗传稳定性考察 1)将原始菌株与诱变菌株PH4tl分别接种于种子培养基(蔗糖：26-32 g/L，酵母浸粉： 15-20g/L，蛋白胨：8-12g/L，（NH4)2S0 4:8-12 g/L，KH2P04:2-4 g/L，MgSO 4:2-4 g/L，VB1: 0· l-0.3g/L，氯化锌：0.01-0.02g/L)中，于26°C，150rpm，培养4d进行发酵培养，蝙蝠蛾 拟青霉诱变菌株菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中，菌体体干重 达14. 40 g/L，较原出发菌株提高了 44. 06 % ;腺苷含量可达0. 1038g/l，较原出发菌提高了 3. 59%;虫草酸含量可达1.275 g/L，较原始菌株提高了 104. 7%;多糖含量可达1.364 g/L， 较原出发菌提高了 139.83%。
[0019] 表1原出发菌株与诱变菌株PH4tl有效成分含量比较
2)为了研宄诱变菌株的高生产性能遗传特性是否稳定，采用群体传代的方法考察 了诱