一种菌株、其诱变方法及其发酵生产脂肪酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种高产脂肪酶的诱变菌株、其诱变方法及 其发酵生产脂肪酶的方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的酶，该酶 在油一水界面上能催化油脂(甘油三酯)水解为甘油、甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸，在 无水有机溶剂中又能催化酯的合成。所以脂肪酶被广泛的用于食品风味改造、手性药物合 成、皮革加工、生物柴油的制备以及作为饲料添加剂。脂肪酶被誉为生物产业中最有价值的 工业酶之一。
[0003]由于微生物脂肪酶比动植物脂肪酶催化作用的pH值和温度范围更宽，且制备相对 更容易，所以目前国内外获得脂肪酶的方法主要是微生物发酵法。很多微生物都有产生脂 肪酶的能力，但是具有高产脂肪酶能力的不多。从自然界中筛选出有较高产酶能力的菌株， 并通过诱变育种等手段提高其产酶能力变得尤为重要。对微生物进行人工诱变育种，具有 快速、高效和简便等优点，是菌种选育的重要途径。在发酵工业菌种选育上具有卓越的成 就，迄今国内外发酵工业中所使用的生产菌株大部分是人工诱变选育出来的。
[0004]利用微生物生产脂肪酶主要有固、液两种发酵方式。霉菌主要采用固态发酵，而细 菌和酵母则主要采用液态发酵。发酵条件对于微生物产脂肪酶十分重要，微生物产脂肪酶 发酵除受温度、pH、溶氧、培养时间影响外，其产量深受培养基组分影响。
【发明内容】
[0005]鉴于上述和/或现有酶基因工程和酶工程领域中存在的问题，提出了本发明。
[0006] 本发明所提供的洋葱伯克霍尔德氏菌Gl-7_4BurkholderiacepaciaG1-7-4,已 于2014年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号:N0:M2014656,地 址：中国，武汉，武汉大学。
[0007]因此，本发明其中一个目的是提供一种洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4。
[0008]为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案:一种 洋葱伯克霍尔德氏菌Gl-7-4BurkholderiacepaciaG1-7-4,保藏编号为CCTCCN0: M2014656。
[0009]本发明其中另一个目的是提供一种洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4的诱变方法。
[0010] 为解决上述技术问题，根据本发明的另一个方面，本发明提供了如下技术方案:一 种洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4的诱变方法，其是先经过紫外光诱变，再经过常压室温等离 子体诱变得到，其中，
[0011] 紫外诱变条件为:紫外灯功率30W、照射距离40cm、浓度为106~108个/mL的菌悬液 6mL、照射时间lmin;
[0012] 常压室温等离子体诱变条件为：以99.99 %氦气作为工作气体，气流量10L/min、电 源功率115W、样品与等离子体发射源之间距离3mm、浓度为106~108个/mL的菌悬液20yL、照 射时间lmin。
[0013]本发明其中再一个目的是提供一种利用洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4生产脂肪酶 的方法。
[0014]为解决上述技术问题，根据本发明的再一个方面，本发明提供了如下技术方案:一 种利用洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4生产脂肪酶的方法，其包括，
[0015] (1)二级种子液培养:将所述洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4在37°C、200~240r/min 条件下培养7~9h，以3%的接种量将一级种子液转接，在37°C、200~240r/min条件下培养5 ~7h制得二级种子液；
[0016] (2)脂肪酶的制得：以8%的接种量将二级种子液接入发酵培养基中，在28°C、200 ~240r/min条件下培养50~54h。
[0017]作为本发明所述的利用洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4生产脂肪酶的方法，其中：在 脂肪酶制得之前，二级种子液培养之后，还包括，
[0018]配制发酵培养基:所述培养基成包括可溶性淀粉、玉米油、酵母膏、PVA、K2HP〇4、烟 酰胺，其初始PH6~7。
[0019]作为本发明所述的利用洋葱伯克霍尔德氏菌G1-7-4生产脂肪酶的方法，其中：所 述二级种子液培养中，OD6QQ值3.0~3.2。
[0020] 本发明提供一种高产脂肪酶的诱变菌株、其诱变方法及其发酵生产脂肪酶的方 法。该菌株为洋葱伯克霍尔德氏菌BurkholderiacepaciaG1-7-4,保藏编号CCTCC M2014656。该诱变菌株G1-7-4由原始菌株G1经过紫外光和常压室温等离子体(ARTP)复合诱 变得到。该诱变菌株G1-7-4在摇瓶发酵后，发酵液酶活达到80U/mL以上。
【具体实施方式】
[0021] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0022]保藏编号为CCTCCM2014656的诱变菌株洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepaciaG1-7-4的16SrDNA分子学鉴定。
[0023]将保藏的诱变菌株G1-7-4划线LB平板活化后，用TaKaRa菌落PCR裂解缓冲液将菌 体裂解，80°C热变性15min后3000r/min离心片刻，以上清液作为PCR反应的模板，用TaKaRa 的PCR扩增细菌16SrDNA试剂盒进行16SrDNA扩增，扩增产物交由生工生物工程(上海)有 限公司进行测序，序列所得结果通过NCBI中的BLAST与Genbank中的模式菌株进行同源性比 对。比对结果显示与Genbank中相关模式菌株的16SrDNA有99%的相似性，将该菌株命名为 洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderiac印aciaG1-7-4,保藏编号为CCTCCM2014656。
[0024]实施例1 :保藏编号为CCTCCM2014656的诱变菌株洋葱伯克霍尔德氏菌BurkholderiacepaciaG1-7-4的诱变方法
[0025]挑取一环保藏的原始菌株G1于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37°C、 220r/min条件下培养10h至对数生长期后，在无菌操作下将菌液在4°C、6000r/min条