专利名称：一种用于As污染土壤修复的微生物菌株的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术中微生物筛选领域，特别涉及一种用于As污染土壤生物修复的微生物菌株的筛选方法。
背景技术：
现有技术重金属污染土壤的修复研究正受到国内外的广泛关注，而生物修复重金属污染土壤更是众所关注的焦点，对As污染土壤也不例外。砷是环境中较受重视的污染物，自从孟加拉国由于地下水砷污染导致大量人群砷中毒以后，砷污染的研究得到国际学术界的广泛关注。许多研究认为食物链传递是人体暴露于砷的主要途径之一。对于东南亚地区以稻米为主食的国家，水稻对砷的吸收积累是一个关系到人体健康的重要环境问题。在我国由于矿业活动和自然因素(地下水污染)也导致大面积的土壤砷污染，对当地乃至区域的食品安全和人体健康构成严重威胁。
土壤中许多微生物通过代谢作用溶解赋存于矿物中的不可利用性形态的重金属元素(Francis and Dodge，1988；Cantafio et al.，1996；Kalinowski et al.，2000)，从而对重金属在土壤中的迁移发挥着重要作用(Gadd，1990；Idris etal.，2004)。As在自然环境中通常主要以砷酸盐[As(V)]和亚砷酸盐[As(III)]形式存在，在氧化环境中，As以As(V)为主；在还原环境中，As以As(III)为主(Keon et al.，2001)。一些微生物菌株能使用As作为电子受体或供体，从而氧化或还原As，改变As污染介质中As的价态，如氧化As(III)(Thermusaquuaticus，T.thermophilus)(Gihring et al.，2001)、(Thiobacillus sp.S1、Ancylobacter sp.OL1)(Rhine et al.，2005)，即把As(III)转变为As(V)，As(V)的毒性较As(III)低。土壤中存在的砷化合物种类较多，但主要以阴离子基团的方式赋存于矿物中，且主要赋存于Fe、Al等矿物中(Wenzel et al.，2001)。而As污染土壤中通常生物可利用性的As含量并不高，在使用超富集As植物原位修复As污染土壤时，限制了超富集植物吸收土壤中As的效率(Meharg andHartley-Whitaker，2002)。因而，有必要寻找恰当的、环境友好的技术手段改变植物修复As污染土壤时的吸收效率。
有报道称植物生长促生菌株能在根际营养不平衡的条件下有助于植物获得关键性元素(Egamberdiyeva and Hflich，2004；Belimov et al.，2005)，并能显著促进植物在Ni、Pb、Zn、Cd、Cu等重金属污染土壤中生长(Burd et al.，1998，2000；Grichko et al.，2000；Nies et al.，2002；Vivas et al.，2006)，但这些研究中使用的菌株通常是从能耐受重金属的浓度进行筛选，很难兼顾筛选出的菌株是否一定能促进植物吸收更多的重金属。此外，这方面的工作中涉及As的研究还几乎没有。
已有的研究表明，土壤中微生物能影响植物形态、生理和营养(Rovira，1965)，并认为产吲哚乙酸(indole acetic acid，1AA)等生长素是微生物利于植物生长的重要原因之一(Brows，1972)。因此，在As胁迫环境下，筛选能产IAA的菌株可能会利于植物生长。
从以上资料可以看出目前，在筛选应用于重金属污染土壤植物修复的微生物菌株时，常常是从菌株耐受重金属浓度的角度进行筛选，该方法很难兼顾菌株是否能有利于植物在重金属污染环境中生长的特性、是否能促进植物吸收更高含量的重金属及修复效率，更没有一种适合用于植物修复As污染土壤的微生物菌株筛选方法。
发明内容
本发明针对目前菌株筛选中存在的问题，提出一种用于As污染土壤生物修复的微生物菌株的筛选方法，该方法可以筛选出有利于植物生长，也能促进植物高效地吸收更多的As，提供植物修复As污染土壤的效率。
本发明的技术解决方案为一种用于As污染土壤生物修复的微生物菌株的筛选方法，筛选步骤为混匀的植物根际土直接接入灭菌的、含As的细菌和真菌液体培养基中，培养基在28℃、120r/min条件下摇床培养一周，每周转接一次，以新鲜液体培养基体积的1％的接种量接入新鲜培养基中，如此重复五次；然后，用梯度稀释法筛选菌株，其中在固体培养基上，细菌采用划线分离法分离，真菌采用点状法分离，得到纯的细菌和真菌单菌落；上述细菌液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，用NaOH溶液将其pH值调节至7.0-7.2的范围；真菌液体培养基为马丁氏培养基，用NaOH溶液调节pH值至约6.5；上述两种液体培养基中还添加有Na2HAsO4，使得两种培养基的As浓度范围为50-1000mg/kg，筛选出耐As程度不同的菌株；向液体培养基中加入2.0％琼脂即可获得相应固体培养基；该步骤将筛选出多种、耐As程度不同的细菌和真菌菌株。将上步所得单菌落分别接种于不含Na2HAsO4的液体牛肉膏蛋白胨培养基和液体马丁氏培养基内培养，再将上述两种培养液分别在4℃下用离心机以8000r/min离心后，倾去上清液，无菌蒸馏水洗涤沉淀物，均以光吸收值OD600＝0.5为基准，用无菌水制成细菌和真菌的菌悬液；接种菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基(不加As)中，再加入γ-射线灭菌过的含As土壤5g，培养10d后，把溶液倒入烧杯中，测定培养液pH，再用蒸馏水洗涤三角瓶中残留物于烧杯中，60℃烘干至衡重，称取1g残留物通过逐级提取法进行As形态的分析，筛选出能改变土壤中As形态的细菌和真菌菌株；该步骤简单易行地从筛选出的菌株中进一步筛选出能显著影响土壤中As与矿物结合方式的细菌和真菌菌株，并能理解菌株作用于土壤中何种As结构。将上步筛选出的细菌、真菌菌株分别接种于不含Na2HAsO4·7H2O的液体牛肉膏蛋白胨培养基和液体马丁氏培养基内培养，将上述两种培养液分别用离心机在8000r/min下离心，离心后所得沉淀物中直接加入3mL pH＝7.5磷酸盐缓冲液(含质量浓度1％的葡萄糖)中，再加入2mL质量浓度1％的L-色氨酸后，在37℃下培养24h，培养结束后，加入2mL质量浓度5％三氯乙酸和1mL 0.5M CaCl2，过滤，移出3mL滤液于测定管中，向管中加入2mL Salper溶液后在25℃的黑暗条件下培养30min，培养结束后用722型分光光度计波长535nm下测定吲哚乙酸含量，标准曲线使用吲哚乙酸0-20mg/L的范围，测定菌株产IAA的量，从而筛选出利于植物生长的菌株、真菌菌株；从该步筛选的菌株中能挑选出兼顾改变土壤中生物可利用态As含量的菌株，又能兼顾As胁迫环境下会利于植株生长。将上步筛选出的菌株、真菌各一株进行盆栽试验，验证各菌株对植物修复自然As污染土壤时植物吸收As含量和效率的影响。该步筛选出的菌株即可用于实际As污染土壤的生物修复中。
本发明与现有技术相比，筛选出的菌株能改变土壤中As与矿物结合方式，使得土壤中As的迁移性增强，并通过产生IAA促进植物生长，增强植物对As的吸收。本发明的目的是筛选出的菌株用于植物修复As污染土壤时，能有利于植物生长，更能促进植物高效地吸收更多的As，提高植物修复As污染土壤的效率。
四
图1为筛选菌株的技术路线图；图2、3为接种菌株对土壤中As形态的改变，不同字母表示不同接种处理土壤中As形态差异达到5％显著水平；非专性吸附态的As代表着土壤中最能被生物利用、最具环境风险的As形态，且也代表着土壤溶液中含有的As，在土壤中该形态的As含量通常较低(Wenzel et al.，2001，2002)，如图2所示，接种细菌B1、B2、B3和接种真F1、F2、F3均显著促进土壤中非专性吸附态As含量的升高(p＜0.05)，B1、B2、B3处理分别是CK的3.2、4.5、3.4倍，F1、F2、F3处理分别是CK的4.4、4.7、3.7倍，即接种菌株提高了土壤中生物可利用性As含量。专性吸附态As含量与非专性吸附态As的变化趋势一致，接种处理均显著促进非专性吸附态As含量的升高(p＜0.05)(图3)，与CK相比，B1、B2、B3分别提高土壤中该形态的As含量47％、48％、31％，F1、F2、F3则分别为26％、36％、18％。
图4为不同菌株代谢产生的IAA含量；不同字母表示不同菌株产生IAA含量差异达到5％显著水平；B1、B2、F1、F2产生的IAA含量见图6，B2处理产生的IAA含量显著最高，是B1处理的3.6倍；而F1处理产生的IAA含量同样显著高于F2处理。可见，通过L-色氨酸诱导，筛选出的两株细菌、两株真菌都能产生IAA。Brows(1972)研究认为根际微生物会产生促进植物生长的物质，如IAA、赤霉酸等，并认为植物有不同的根和地上部形态可能与植物根际微生物代谢的IAA有关。如把这些菌株接种到植株根际，将有利于植物在高As污染土壤这种胁迫环境中生长，因此本研究中这些菌株应该属于根际促生微生物菌株。
如图5所示，不同字母表示不同接种处理蜈蚣草生物量差异达到5％显著水平；接种菌剂均不同程度地促进蜈蚣草地上部和地下部生物量的增加。与对照相比，接种F2处理的蜈蚣草地下部和地上部生物量显著高于对照，菌株B1对蜈蚣草地上部和地下部生物量均有促进作用，但不显著(p＜0.05)。可见，接种B1和F2对蜈蚣草修复As污染土壤时有利于植株生长。
图6为接种B1、F2对蜈蚣草吸收As浓度的影响，不同字母表示不同接种处理蜈蚣草As浓度差异达到5％显著水平；与对照相比，接种处理的蜈蚣草地上部和地下部As浓度均高于对照，尤其是对蜈蚣草地上部As浓度的促进作用更显著(p＜0.05)，B1、F2处理的地上部As浓度分别是对照的2.3、1.9倍。
图7为接种B1、F2对蜈蚣草吸收As含量的影响，不同字母表示不同接种处理蜈蚣草As含量差异达到5％显著水平；与对照相比，接种B1、F2均显著促进了地上部和地下部吸收的As含量(p＜0.05)，尤其是地上部As含量B1、F2处理分别是对照的2.5、2.7倍。蜈蚣草是超富集As植物，超量吸收的As主要转运至地上部，而对As或其它重金属污染土壤植物修复时，最希望的就是通过植物把土壤中的污染物转运到植株地上部，然后收割地上部以便于移除土壤中的污染物浓度。本研究中筛选的菌株B1、F2均促进蜈蚣草地上部吸收的As含量的增加，尤其在高浓度As污染土壤中，接种菌株对蜈蚣草地上部吸收As的促进作用更显著。
由以上七幅附图可以看出(1)单接B1、B2、B3、F1、F2、F3于含As土壤中，均显著促进土壤中非专性和专性吸附态As含量的升高，提高了土壤中As的生物可利用性。
(2)筛选出的三株细菌、三株真菌都能产生IAA。
(3)筛选的菌株B1、F2均显著促进蜈蚣草地下部和地上部吸收As含量的增加，接种菌株对蜈蚣草地上部吸收As的促进作用更显著，B1、F2处理分别是对照的2.5、2.7倍。
五具体实施例方式
实施例11.1供试土壤分离菌株的土壤取自湖南省石门县As矿区附近的菜地中，土壤类型为黄壤，土壤理化性质为pH 4.20(水土比，2.5∶1)，总As 412mg/kg，总P 0.45％，Al 7.8％，Fe 4.65％。
自然风干后的土壤研磨过100目尼龙筛，采用60Co灭菌，灭菌剂量率为1.138kGy/h，间歇灭菌两次，总剂量为25kGy。灭菌后的土壤保存在-80℃冰箱中。
1.2供试菌株细菌和真菌的筛选和分离过程如下5g混匀的根际土直接接入121℃湿热灭菌的100mL含500mg/kg As的细菌和真菌培养基中，28℃、120r/min摇床培养一周。以后每周转接一次，以新鲜液体培养基体积的1％的接种量接入新鲜培养基中，如此重复五次，梯度稀释法筛选菌株，细菌采用划线分离法分离，真菌采用点状法分离，得到纯的单菌落。牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L，用NaOH溶液调节pH值至7.0-7.2的范围(中国科学院南京土壤研究所微生物室编著，1985)。马丁氏(Martin)培养基(真菌)MgSO4·7H2O0.5g/L、KH2PO41.0g/L、葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L，用NaOH溶液调节pH值至6.5(中国科学院南京土壤研究所微生物室编著，1985)。上述两种培养基中分别添加Na2HAsO4，使得培养基中含As浓度为500mg/kg。向液体培养基中加入2.0％琼脂即可得相应固体培养基。
1.3试验设计本试验设置处理如下B1、F1以及1个不接种的对照(CK)，总计3个处理，每个处理重复3次，总计9瓶。分别接种配置好的菌悬液2mL于装有50mL牛肉膏蛋白栋培养基(不加Na2HAsO4)的三角瓶中，在不接种的对照处理(CK)中同样加入2mL无菌水，以确保培养溶液体积一致。接种完毕后，称取5g60Co-γ射线灭菌后的土壤于上述培养液中，培养10天后，把溶液倒入烧杯中，测定pH，蒸馏水洗涤三角瓶中残留物于烧杯中，60℃烘干至衡重，称取1g土壤样品进行As形态的分析。
1.4测试项目土壤中As形态采用改进的逐级提取法(Wenzel et al.，2001)①Ass，非专性吸附态，0.05mol/L(NH4)2SO4，20℃/4h；②Asp，专性吸附态，0.05mol/LNH4H2PO4，20℃/16h；③Aso，非晶态的水合Fe、Al氧化物态，0.2mol/L(NH4)2C2O4，pH 3.25，20℃/4h(黑暗条件下)；④Asc，晶态的水合Fe、Al氧化物态，0.2mol/L(NH4)2C2O4+抗坏血酸，pH 3.25，96℃/0.5h(伴有光照)。
吲哚乙酸(IAA)的测定(Vivas et al.，2006)把培养24h的细菌、真菌菌液在8000r/min下离心8min。直接加入3mL pH＝7.5的磷酸盐缓冲液(含1％的葡萄糖)、2mL1％L-色氨酸溶液于离心后的菌体中，在37℃下培养24h。培养结束后，加入2mL5％三氯乙酸和1mL0.5MCaCl2，过滤，移出3mL滤液于测定管中，加入2mLSalper溶液(配方2mL0.5MFeCl3和98mL35％高氯酸混合)。该溶液在25℃的黑暗条件下培养30min，培养结束后在535nm下用722型分光光度计测定。
土壤样品的理化性质pH以土∶水(无CO2)＝1∶2.5法测定(鲁如坤，2002)。用HNO3-HF-HClO4消化后，ICP-MS测定总P。采用1∶1王水消化后的溶液样品与As形态分析样品都采用氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)测定As。选用中国地质科学院地球物理化学勘探研究所的土壤标准样品(GBW07406)控制分析的准确性，P、As的回收率均控制在误差范围内。
1.5数据统计采用SPSS10.0软件处理试验数据，Duncan多重比较各处理之间的差异显著性。
实施例22.1供试土壤分离菌株的土壤取自湖南省慈利县As矿区附近的土丘上，土壤类型为石灰(岩)土，土壤理化性质为pH 5.97(水土比，2.5∶1)，总As 514mg/kg，总P618mg/kg，Al 3.18％，Fe 2.77％。
2.2试验菌株供试菌株分离的方法为先从土壤中筛选能产生IAA的菌株，再从这些菌株中筛选能够改变土壤中As形态的菌株，具体实施步骤同1.2中。
2.3实验设计同1.3。
筛选菌株对土壤As形态影响实验中，选用的土壤以实施例1中60Co灭菌土壤为供试土壤。
2.4测试项目同1.4。
2.5数据统计同1.5。
实施例33.1供试土壤分离菌株的土壤取自湖南省桂阳县土法炼As厂区附近的土丘上，土壤类型为赤红壤，土壤理化性质为pH 3.91(水土比，2.5∶1)；总As 373mg/kg；总P225mg/kg，Al 2.64％，Fe 1.76％。
3.2供试菌株供试菌株分离的方法为从土壤中筛选能产生IAA的菌株、并能够改变土壤中As形态的菌株，具体实施步骤同1.2，从中挑选出效果最佳的菌株。
上述分离菌株经初步鉴定，实例1、2筛选的细菌均为短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、实例3筛选的细菌为芽孢杆菌属(Bacillus)(东秀珠等，2001)，以下简称为B1、B2、B3；实例1、2、3筛选的真菌分别为(康氏)木霉属(Trichoderma)、镰孢霉属(Fusarium)、单囊白粉菌属(Sphaerotheca)(魏景超，1979)，以下简称为F1、F2、F3。
3.3试验设计同1.3。
筛选菌株对土壤As形态影响实验中，选用的土壤也以实施例1中60Co灭菌土壤为供试土壤。
3.4测试项目同1.4。
3.5数据统计同1.5。
实施例4筛选的B1、F2菌株对蜈蚣草吸收As含量的效果4.1材料与方法4.1.1供试植物蜈蚣草(Pteris vittata L)进行实验前，先把孢子播种于湿热灭菌后的湿润土壤中，待长出约2cm时移植到同样灭菌后的湿润土壤中。蜈蚣草苗长到约5cm高时即可进行实验。
4.1.2供试土壤供试的土壤分别采自湖南省石门县As采矿区山脚处。采集土壤时剔除表层植物凋落物，取表层0～20cm土壤，多点采集混匀。自然风干，过2mm尼龙筛。
表1供试土壤基本性质
土壤的基本理化性质见表1矿区山脚处农田土壤已受As污染较严重，是国家土壤环境3级标准(40mg/kg-1)4.63倍，而这些土壤现正在耕种中，可见，该区内土壤中种植的农产品将可能会对区内居民构成健康威胁。
4.1.3供试菌剂本试验仅选用B1、F2两种菌株。接种菌剂制备方法接种B1、F1分别于上述牛肉膏蛋白栋培培养基和马丁氏培养基(不加Na2HAsO4·7H2O)，培养3d后，在4℃下8000r/min离心菌株，倾去上清夜，用无菌蒸馏水洗涤菌株三次后，均以光吸收值OD600＝0.5为基准，用无菌水制成菌悬液。
4.1.4试验设计试验以盆栽的方式进行，土壤不灭菌，设定处理为接种B1、F2以及1个不接种的对照，每个处理设3次重复，共3个处理，总计9盆。试验采用1.5L塑料盆，每盆装土1kg，接种菌悬液20mL，CK处理浇20mL蒸馏水，与土壤混匀。每盆播种移蜈蚣草苗3棵。所有盆随机排列于中国科学院南京土壤研究所日光温室中，浇蒸馏水，维持土壤最大持水量的80％。
蜈蚣草生长14周后收获，地上部和地下部分别于60℃烘干至恒重后分别称取干重。根际土壤混合后，每盆取100g土样，自然风干后研磨过100目尼龙筛，样品保存供测定各项指标。
4.1.5植物样品测定植物样品用HNO3∶HCl＝3∶1进行消化后的样品，采用氢化物发生器-原子荧光光谱法(HG-AFS)测定As。植物样品采用浓HNO3和HClO4消化后，电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-AES)测定P。选用中国地质科学院地球物理化学勘探研究所的植物标准样品(GBW07603)控制分析的准确性，各元素测值均在准确范围内。
4.1.6数据统计采用SPSS10.0软件处理试验数据，Duncan多重比较各处理之间的差异显著性。
权利要求
1.一种用于As污染土壤修复的微生物菌株的筛选方法，其特征在于筛选步骤为a.将混匀的植物根际新鲜土直接接入灭菌的含As的细菌和真菌液体培养基中，其中，细菌液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，用NaOH溶液将其pH值调节至7.0-7.2的范围，真菌液体培养基为马丁氏培养基，用NaOH溶液调节pH值至约6.5，两种液体培养基中添加有Na2HAsO4，使得两种培养基的As浓度为50-1000mg/kg，两种培养基在28℃、120r/min条件下摇床培养一周，每周转接一次，每次转接时以新鲜液体培养基体积的1～5％的接种量接入新鲜培养基中，如此重复三～五次；然后，用梯度稀释法分离菌株得到纯的细菌和真菌单菌落；b.将上步所得单菌落分别接种于不含Na2HAsO4的液体牛肉膏蛋白胨培养基和液体马丁氏培养基内培养，将两种培养液分别在4℃下离心后，倾去上清液，用无菌蒸馏水洗涤沉淀物，再用无菌水制成细菌和真菌的菌悬液；c.接种上述菌悬液于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨培养基中，再加入γ-射线灭菌As污染土壤，培养结束后，把溶液倒入烧杯中，用水洗涤三角瓶中残留物于烧杯中，烘干至衡重，通过逐级提取法对残留物进行As形态的分析，从而筛选出能改变土壤中As形态的细菌和真菌菌株；d.将上步筛选出的细菌、真菌菌株分别接种于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨液体培养基和马丁氏液体培养基内培养，将上述两种培养液分别离心，离心后所得沉淀物中直接加入3mL pH＝7.5含质量浓度1％的葡萄糖的磷酸盐缓冲液中，再加入2mL质量浓度1％的L-色氨酸后，在37℃下培养24h，培养结束后，加入2mL质量浓度5％三氯乙酸和1mL 0.5mol/LCaCl2，过滤，移出3mL滤液于测定管中，向管中加入2mL Salper溶液后在25℃的黑暗条件下培养30min，培养结束后在用722型分光光度计波长535nm下测定吲哚乙酸含量，标准曲线使用吲哚乙酸0-20mg/L的范围，测定菌株产IAA的能力，从而筛选出利于植物生长的细菌菌株、真菌菌株。
全文摘要
一种用于As污染农田土壤植物修复的微生物菌株的筛选方法。从As污染土壤中先筛选能耐As的菌株，通过逐级提取方法分析这些菌株是否能改变γ－射线灭菌的As污染土壤中的As形态、以及是否产生能促进植物生长的吲哚乙酸(IAA)，从而筛选出能够改变土壤中生物可利用态As含量的菌株，并通过盆栽试验验证通过此方法筛选菌株能利于植物生长和增加植物吸收的As量和效率。本发明的方法操作简便，操作环境友好，且用于植物修复时不会带来二次污染，处理成本降低，而植物修复As污染土壤的效率提高。
文档编号B09C1/10GK101067115SQ200710023489
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年6月5日
发明者白建峰, 林先贵, 尹睿, 王一明 申请人:中国科学院南京土壤研究所