专利名称：使用肠杆菌科菌株制备l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用肠杆菌科的重组微生物菌株生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸的方法，所述菌株中命名为yaaU的可读框(ORF)被增强，特别是过表达；本发明还涉及所述微生物。
背景技术：
L-氨基酸，特别是L-苏氨酸被应用于人体医学和药品工业、食品工业、特别是动物营养中。
已知可以通过发酵肠杆菌科菌株，特别是大肠杆菌(E.Coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)生产L-氨基酸。由于其极为重要，一直在持续努力对生产方法进行改进。对方法的改进可以涉及与发酵技术相关的措施，例如搅拌或供氧、或营养培养基的组成例如发酵过程中的糖浓度、或例如通过离子交换层析对产品形式的处理、或微生物本身的内在性能特性。
诱变、选择及突变体选择的方法被用于改良这些微生物的性能特性。这由此获得了对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性的或对调节重要的代谢物是营养缺陷的，并产生L-氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。
多年以来，也已通过扩增各氨基酸生物合成基因并研究其对生产的影响，将重组DNA方法用于肠杆菌科的产L-氨基酸的菌株的改良。关于大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)的细胞生物学和分子生物学的汇编资料见于Neidhardt(ed)Escherichia coli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，2ndedition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)。
发明目的本发明的目的是提供用于提高L-氨基酸尤其是L-苏氨酸生产的新措施。
发明内容
本发明涉及肠杆菌科的重组微生物，其含有增强的或过表达的yaaU-ORF，其编码一种被注解为推定的糖转运蛋白的多肽；且其以一种改良的方式生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸。
在各种情形中，将非yaaU-ORF重组体微生物或不含有任何增强的yaaU-ORF的微生物用作比较的起始点。
这些重组微生物特别包括肠杆菌科的微生物，其中一种多核苷酸被增强，所述多核苷酸编码一种多肽，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性为至少90％，特别地至少95％，优选至少98％，更优选99％，特别优选99.7％和甚至特别优选100％。优选与来自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
所述微生物含有一种增强的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸选自a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遗传密码简并范围内对应于SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在严格条件下，与序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的互补序列杂交的序列的多核苷酸序列；
d)具有含有在功能上为中性意义的突变的序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的多核苷酸，该多核苷酸编码推定的糖转运蛋白。
本发明还涉及使用肠杆菌科的重组微生物发酵生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸的方法，特别地，所述重组微生物已经生产L-氨基酸且其中至少编码yaaU的可读框(ORF)或编码其基因产物的核苷酸序列被增强。
优选使用所描述的微生物。
当下文提及L-氨基酸或氨基酸时，是指选自如下一组的一或多种氨基酸，包括其盐L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。特别优选L-苏氨酸。
在本申请中，术语“增强”描述了微生物中由相应DNA所编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的增加，通过例如使一或多种基因或一或多种ORF的拷贝数增加至少一个(1)拷贝，采用可操纵地连接于所述基因的强启动子或采用编码相应的具有高活性的酶或蛋白质的基因或等位基因或ORF，且在适当的地方可以组合使用这些措施。
可读框(ORF)是指编码或可以编码现有技术中未知功能的蛋白质和/或多肽或核糖核酸的核苷酸序列的片段。在确定了所述核苷酸序列片段的功能之后，这一片段通常被称作基因。等位基因通常被理解为是给定基因的替代形式。这些形式通过核苷酸序列的不同而区分。
通常，将由核苷酸序列(即ORF、基因或等位基因)所编码的蛋白质或核糖核酸称作基因产物。
增强措施，尤其是过表达，通常使得相应的蛋白质的活性或浓度在野生型蛋白质的活性或浓度的基础上，或在亲代菌株或非相应酶或蛋白质重组体微生物中的蛋白质的活性或浓度的基础上增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最高直至1000％或2000％。非重组体微生物或亲代菌株是指实施了本发明的措施的微生物。
本发明涉及通过发酵肠杆菌科的重组微生物制备L-氨基酸的方法，其特征在于a)在培养基中培养所需的L-氨基酸生产微生物，在所述微生物中可读框yaaU或编码其基因产物的多种核苷酸序列或多种等位基因被增强尤其是过表达，所述培养在所需L-氨基酸在培养基或细胞中富集的条件下进行；和b)分离所需的L-氨基酸，任选地，发酵液组分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分离的产物中或被完全除去。
具有增强的或过表达的可读框(ORF)yaaU的微生物，尤其是重组微生物同样是本发明主题的一部分，可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、适当的时候从淀粉、纤维素或从甘油和乙醇产生L-氨基酸。这些微生物是肠杆菌科的代表性微生物，它们选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属中尤其可提及的是大肠杆菌菌种，在沙雷氏菌属尤其可提及的是粘质沙雷氏菌菌种。
通常，采用含有所需ORF、所需基因、该ORF或基因的等位基因，或其部分，和/或增强所述ORF或基因的表达的启动子，通过转化、转导或接合的方式，或这些方法的组合产生重组微生物。这一启动子可以是通过位于所述基因或ORF上游的内源调节序列的增强突变所产生的启动子；或与所述基因或ORF融合的有效启动子。
埃希氏菌属尤其大肠杆菌菌种的合适菌株，尤其是生产L-苏氨酸的合适菌株的例子是-大肠杆菌H4581 (EP 0 301 572)-大肠杆菌KY10935(Bioscience Biotechnology andBiochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大肠杆菌VNIIgenetica MG442 (US-A-4278,765)-大肠杆菌VNIIgenetica M1(US-A-4,321,325)-大肠杆菌VNIIgenetica 472T23(US-A-5,631,157)-大肠杆菌BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)-大肠杆菌cat 13 (WO 98/04715)-大肠杆菌KCCM-10132 (WO 00/09660)沙雷氏菌属，特别是粘质沙雷氏菌菌种的合适的L-苏氨酸生产菌株的例子是-粘质沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)1045-1051(1979))-粘质沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘质沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)255-265(1992)肠杆菌科的L-苏氨酸生产菌株优选具有尤其是选自如下一组的一或多种遗传或表型特征α-氨基β-羟戊酸抗性、硫赖氨酸(thialysine)抗性、乙硫氨酸抗性、α-甲基丝氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氨基丁酸抗性、疏螺旋体素抗性、环戊烷羧酸抗性、利福平抗性、缬氨酸类似物例如缬氨酸氧肟酸抗性、嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性、需要L-甲硫氨酸、可部分且可补偿地需要L-异亮氨酸、需要间二氨基庚二酸、对含苏氨酸的二肽为营养缺陷型、L-苏氨酸抗性、苏氨酸萃余液(raffinate)抗性、L-高丝氨酸抗性、L-赖氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-丝氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-缬氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性、缺陷型苏氨酸脱氢酶、可利用蔗糖的能力、苏氨酸操纵子的增强、高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的增强，优选反馈抗性形式、高丝氨酸激酶的增强、苏氨酸合酶的增强、天冬氨酸激酶的增强，可为反馈抗性形式、天冬氨酸半醛脱氢酶的增强、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，可为反馈抗性形式、磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强、转氢酶的增强、RhtB基因产物因产物的增强、RhtC基因产物的增强、YfiK基因产物的增强、丙酮酸羧化酶的增强、及乙酸形成的弱化。
已经发现肠杆菌科的微生物在基因或可读框(ORF)yaaU，或其等位基因过表达后以改良的方式生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸。
大肠杆菌的基因或可读框(ORF)的核苷酸序列属于现有技术，也可以在Blattner等(Science 2771453-1462(1997))公开的大肠杆菌基因组序列获得。已知内源酶(甲硫氨酸氨肽酶)能剪切N-末端氨基酸甲硫氨酸。
来自同样属于肠杆菌科的弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的yaaU-ORF的核苷酸序列也已公开。
大肠杆菌K12的yaaU ORF尤其通过如下数据描述描述可读框功能被注解为一种推定的转运蛋白，MFS(主要易化超家族(major facilitator superfamily))家族的膜转运蛋白。所转运的底物变化范围很大；所述MFS家族包含单糖、二糖和寡糖转运蛋白，钾和氨基酸转运蛋白，用于三羧酸循环的中间体的转运蛋白，以及将抗生素泵出细胞外的转运蛋白。
描述可读框yaaU编码48.7kDa的蛋白质；等电点为8.8；当在染色体上进行定位时，yaaU例如在大肠杆菌K12 MG1655中位于编码氨甲酰磷酸合酶的长链的基因carB和编码(K(+)/H(+)谷胱甘肽-调节的钾流系统蛋白质((K(+)/H(+)glutathione-regulated potassiumefflux system protein)的基因kefC的基因间区域。
参考文献Blattner et al.；Science 277(5331)1453-1474(1997)登录号AE000114替代的基因名B0045核酸序列可从属于National Library of Medicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for Biotechnology Information(NCBI)的数据库、European Molecular Biology Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany or Cambridge，UK)的核酸序列数据库或日本DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)获得。
为使得更为清楚，大肠杆菌yaaU-ORF的已知序列示于SEQ IDNO3，弗氏志贺氏菌(AE015041)和鼠伤寒沙门氏菌(AE008697)的yaaU-ORF的已知序列分别示于SEQ ID NO5和SEQ ID NO7。由这些读框编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO4、SEQ IDNO6和SEQ ID NO8。
提及的参考文献中所描述的可读框根据本发明可以使用。此外，也可以使用由遗传密码的简并性或者在功能上为中性意义的突变所产生的所述基因或可读框的等位基因。优选使用内源基因或内源可读框。
“内源基因”或“内源核苷酸序列”是指一个物种群体中存在的基因或可读框或等位基因或核苷酸序列。
yaaU-ORF的合适的等位基因尤其包括那些在它们所编码的蛋白质中产生了至多50个或至多40个或至多30个或至多20个，优选至多10个或至多5个，尤其优选至多3个或至多2个或至多1个保守氨基酸取代的等位基因，所述等位基因含在功能上为中性意义的突变。
在芳族氨基酸的情形中，当苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。在疏水性氨基酸的情形中，当亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。在极性氨基酸的情形中，当谷氨酰胺和天冬酰胺彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。在碱性氨基酸的情形中，当精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。在酸性氨基酸的情形中，当天冬氨酸和谷氨酸彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。在含羟基基团的氨基酸的情形中，当丝氨酸和苏氨酸彼此相互取代时，所述取代被认为是保守性的。
同样，也可以使用编码所述蛋白质的变体的核苷酸序列，所述变体在其N或C末端额外地含有至少一个(1)氨基酸的延长或截短。这种延长或截短总计不超过50、40、30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸残基。
合适的等位基因还包括编码其中插入或缺失了至少一个(1)氨基酸的蛋白质的那些等位基因。这种称为插入/缺失(indels)的改变的最大数目可涉及2、3、5、10、20但决不超过30个氨基酸。
合适的等位基因还包括使用SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7或其部分，特别是编码区或与其互补的序列，通过杂交、特别是在严格条件下的杂交可获得的那些等位基因。
本领域技术人员尤其可以在Boehringer Mannheim GmbH所提供的专业手册“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)及Liebl et al.(Intemational Journal ofSystematic Bacteriology 41255-260(1991))中找到通过杂交的方式鉴定DNA序列的操作指南。杂交在严格条件下发生，也就是说只形成了其中探针和靶序列(即用探针处理的多核苷酸)具有至少80％相同性的杂交体。已知通过改变缓冲液组成、温度和盐浓度可以影响和/或确定杂交包括洗涤步骤的严格性。通常，杂交反应在与洗涤步骤相比相对较低的严格条件下进行(Hybaid Hybridization Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，相应于5×SSC缓冲液的缓冲液可用于在大约50℃-68℃的温度下进行杂交反应。在这些条件下，探针也可以和与探针序列具有少于70％相同性的多核苷酸杂交。这些杂交体稳定性较低并在严格条件下通过洗涤而除去。这可以例如通过将盐浓度降低至2×SSC及在适当的地方再随后降低至0.5×SSC(The DIG System User′sGuide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，并将温度调节至大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃而实现。优选大约64℃-68℃或大约66℃-68℃的温度范围。在适当的地方，有可能将盐浓度降低至相应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。与所用的探针序列或SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7中所示的核苷酸序列例如具有至少80％、或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的多核苷酸片段有可能通过将杂交温度从50℃逐步(大约1-2℃)提高至68℃而分离。关于杂交的进一步的指导可以所谓试剂盒的形式商购获得(例如DIG EasyHyb，Roche Diagnostics′GmbH，Mannheim，Germany，CatalogueNo.1603558)。由此所获得的核苷酸序列编码与SEQ ID NO4、SEQID NO6或SEQ ID NO8中所述氨基酸序列具有至少90％、尤其是至少95％、优选至少98％或至少99％，尤其优选99.7％的相同性的多肽。
为了实现增强，例如可以提高所述基因或可读框或等位基因的表达，或提高所述蛋白质的催化特性。在适当的地方，可以将两种措施组合起来。
为了实现过表达，例如可以增加相应的基因或可读框的拷贝数，或位于结构基因上游的启动子区域和调节区域或核糖体结合位点是突变的。掺入到所述结构基因上游的表达盒以同样的方式发挥作用。也可以通过掺入诱导型启动子提高发酵生产L-苏氨酸过程中的表达；此外，使用用于基因表达的启动子也是有利的，所述基因表达允许不同时序的基因表达。通过用于延长mRNA的生命期的措施同样提高了表达。此外，通过阻止酶蛋白被破坏也增强了酶活性。ORF、基因或基因构建体或可以以不同的拷贝数存在于质粒中，或被整合和扩增到染色体中。或者，也可以通过改变培养基的组成和培养的实施而实现所涉及到的基因的过表达。
用于过表达的方法在现有技术中已有充分描述，例如Makrideset al.(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))。使用载体增加至少1个(1)拷贝的拷贝数。所使用的载体可以是质粒，如在US5,538,873中所述的质粒。所使用的载体也可以是噬菌体，例如在EP 0332448中所述的噬菌体Mu，或噬菌体λ。也可以通过在染色体中的另一位点掺入额外的拷贝而增加拷贝数，例如掺入噬菌体λ的att位点(Yu and Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307报道了可以通过例如在染色体苏氨酸操纵子的上游掺入表达盒或启动子(例如tac启动子、trp启动子、lpp启动子、或噬菌体λ的PL启动子或PR启动子)来提高表达。同样地，可以使用噬菌体T7启动子、gearbox启动子或nar启动子。也可以使用如EP 0 593 792中所描述的这种表达盒或启动子以过表达质粒结合基因(plasmid-boundgenes)。使用lacIQ等位基因反过来使得有可能调节质粒结合基因的表达(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。此外，还可以通过一个或多个核苷酸的取代、插入/和或缺失对启动子序列进行修饰而提高所述启动子的活性。如Walker et al.(Journal ofBacteriology 1811269-80(1999))所述，通过使用生长期依赖型fis启动子可以实现不同时序的基因表达。
本领域技术人员尤其可以在Chang和Cohen(Journal ofBacteriology 1341141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene 13347-353(1981))、Amann and Brosius(Gene 40183-190(1985))、de Broer et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 8021-25(1983))，LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY11187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosaet al.(Plasmid 26222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))，Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))和已知的遗传学和分子生物学的教科书中找到关于此的一般操作指南。
可以使用能在肠杆菌中进行复制的质粒载体，例如pACYC184-衍生的克隆载体(Bartoloméet al.；Gene 10275-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene 69301-315(1988))或pSC101衍生物(Vocke andBastia；Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在根据本发明的方法中，可以使用由质粒载体所转化的菌株，所述载体携带有至少1种编码yaaU ORF或其基因产物的核苷酸序列或等位基因。
术语“转化”是指宿主(微生物)对分离的核酸的摄入。
也可以利用序列交换(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、接合或转导将影响给定基因或可读框的表达的突变转移到不同菌株中。
有关遗传学和分子生物学概念的更详细的解释见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Birge(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5th ed.，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)所著教科书或Sambrook et al.(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(3-Volume Set)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)所著手册。
此外，当使用肠杆菌科的菌株生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸时，除增强可读框yaaU之外，增强已知的苏氨酸生物合成途径的一或多种酶或添补代谢的酶或用于生产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或糖酵解的酶或PTS酶或硫代谢的酶是有利的。通常优选使用内源基因。
因此，可以例如同时增强尤其是过表达选自如下一组的一或多个基因·至少一种编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的基因(US-A-4,278,765)，·编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因(WO 99/18228)，·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)，
·编码嘧啶转氢酶亚基的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，·编码介导高丝氨酸抗性的蛋白质的rhtB基因(EP-A-0 994190)，·编码介导苏氨酸抗性的蛋白质的rhtC基因(EP-A-1 013765)，·编码苏氨酸输出载体蛋白的谷氨酸棒杆菌的thrE基因(WO01/92545)，·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，·编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(WO 03/004598)，·编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(WO 03/004664)，·编码PTS磷酸转移酶系统的磷酸-组氨酸蛋白质己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子的ptsH基因(WO 03/004674)，·编码PTS磷酸转移酶系统的酶I的ptsHIcrr操纵子的ptsI基因(WO 03/004674)，·编码PTS磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性IIA成分的ptsHIcrr操纵子的crr基因(WO 03/004674)，·编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，·编码亮氨酸调节子的调节物的1rp基因(WO 03/004665)，·编码fad调节子的调节物的fadR基因(WO 03/038106)，·编码中心中间代谢(central intermediate metabolism)的调节物的iclR基因(WO 03/038106)，·编码烷基过氧化氢还原酶的小亚基的ahpCF操纵子的ahpC基因(WO 03/004663)，
·编码烷基过氧化氢还原酶的大亚基的ahpCF操纵子的ahpF基因(WO 03/004663)，·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，·编码cys调节子的调节物的cysB基因(WO 03/006666)，·编码NADPH亚硫酸还原酶黄素蛋白的cysJIH操纵子的cysJ基因(WO 03/006666)，·编码NADPH亚硫酸还原酶血红素蛋白的cysJIH操纵子的cysI基因(WO 03/006666)，·编码腺苷酰硫酸还原酶的cysJIH操纵子的cysH基因(WO03/006666)，·编码具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操纵子的rseA基因(WO 03/008612)，·编码sigmaE因子的全局调节物的rseABC操纵子的rseC基因(WO 03/008612)，·编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucABCD操纵子的sucA基因(WO 03/008614)，·编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基的sucABCD操纵子的sucB基因(WO 03/008614)，·编码琥珀酰-CoA合成酶的β亚基的sucABCD操纵子的sucC基因(WO 03/008615)，·编码琥珀酰-CoA合成酶的α亚基的sucABCD操纵子的sucD基因(WO 03/008615)，·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因(WO03/076635)，·编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因(WO03/076635)，
·编码sigmaE因子活性的调节物的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))，和·大肠杆菌yodA可读框(ORF)的基因产物(Accession NumberAE000288，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA，DE10361192.4)。
此外，为了生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸，除增强可读框yaaU之外，弱化特别是消除或降低选自如下一组的一或多个基因的表达对生产L-氨基酸特别是苏氨酸是有利的·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，·编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives inMicrobiology 14936-42(1987))，·大肠杆菌yjfA可读框(ORF)的基因产物(Accession NumberAAC77180，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·大肠杆菌ytfP可读框(ORF)的基因产物(Accession NumberAAC77179，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，·编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因(WO02/081721)，其也已知称作mlc基因，·编码果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，其也已知称作cra基因，·编码sigma38因子的rpoS基因(WO 01/05939)，其也已知称作katF基因，和
·编码天冬氨酸铵裂合酶的aspA基因(WO 03/008603)。
在本申请中，术语“弱化”描述的是在微生物中由相应的DNA所编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的降低或消除，例如通过使用较亲代菌株或非相应酶或蛋白质重组体微生物中的启动子更弱的启动子、或编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因、或灭活相应酶或蛋白质或所述可读框或基因，及在适当的地方组合使用这些措施。
通常，弱化措施使得相应蛋白质的活性或浓度降低至野生型蛋白质的活性或浓度，或亲代菌株或非相应酶或蛋白质重组体微生物的蛋白质的活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。亲代菌株或非重组体微生物是指实施了本发明的措施的微生物。
为了实现弱化，例如可以降低或消除所述基因或可读框的表达或所述酶蛋白的催化特性。在适当的地方，可组合使用这两种措施。
可以通过遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构，或通过反义RNA技术，以适当的方式进行培养而降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员尤其可在如下文献中发现此方面的信息，例如Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))、Carrier和Keasling(Biotechnology Progress 1558-64(1999))、Franch和Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3159-164(2000))，以及遗传学和分子生物学的已知教科书例如由Knippers所提供的教科书(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”，6th edition，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，1995)或Winnacker所提供的教科书(“Gene und Klone[Genes and Clones]”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)。
导致酶蛋白催化特性的改变或降低的突变是现有技术中所已知的。可提及的例子如Qiu和Goodman (Journal of BiologicalChemistry 2728611-8617(1997))、Yano et al.(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 955511-5515(1998))以及Wente和Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 26620833-20839(1991))等文章。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如由Hagemann所提供的教科书(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可考虑的突变有至少一个(1)碱基对或核苷酸的转换、颠换、插入和缺失。根据突变引发的氨基酸取代对酶活性的影响，参见错义突变或无义突变。错义突变使得蛋白质中的给定氨基酸被不同的氨基酸所置换，所述氨基酸置换尤其是非保守性的。这因此削弱了所述蛋白质的功能性或活性，并将其降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％的量。无义突变在基因的编码区产生了一个终止密码子，并因此提前终止翻译。基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致了移码突变，这反过来导致掺入不正确的氨基酸或导致翻译提前终止。如果所述突变的结果是在编码区形成一个终止密码子，这随后也会导致翻译提前终止。典型地，至少一个(1)或多个密码子的缺失也将导致酶活性的完全丧失。
产生这些突变的指示属于现有技术，且可以从遗传学和分子生物学的已知教科书获得例如由Knippers所著教科书(“MolekulareGenetik[Molecular Genetics]”，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker所著教科书“Gene und Klone，[Genes and Clones]”，VHC Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann所著教科书(“Allgemeine Genetik [GeneralGenetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可以将基因中的适当突变通过基因或等位基因交换掺入适当的菌株中。一种常用的方法是Hamilton et al.(Journal of Bacteriologv1714617-4622(1989))所描述的利用条件复制型pSC101衍生物pMAK705的基因交换方法。也可以使用现有技术中所描述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1817143-7148(1999))或Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182842-847(2000))所描述的方法。
同样可以将相关基因中的突变或影响相关基因或可读框的表达的突变以连合或转导的方式转移至不同的菌株中。
此外，为了生产L-氨基酸尤其是L-苏氨酸，除增强可读框yaaU之外，消除不需要的副反应是有利的(Nakayama“Breeding ofAmino Acid Producing Microorganisms”，inOverproduction ofMicrobial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根据本发明所制备的微生物可以在分批工艺、补料分批工艺、重复补料分批工艺或连续发酵工艺(DE102004028859.3或US5,763,230)中进行培养。已知的培养方法概述于Chmiel所著教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocess technology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas所著教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralinstallations](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中。
待使用的培养基必须以适当方式满足特定菌株的需求。美国细菌学会(The American Society for Bacteriology)手册“Manual ofMethods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)包含用于培养多种微生物的培养基的描述。
可以将糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉以及适当的地方纤维素、油和脂肪(如豆油、葵花油、花生油和椰子油)、脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇如甘油和乙醇、及有机酸如乙酸用作碳源。这些物质可单独或混合使用。
可以将含氮的有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素)或无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)用作氮源。氮源可单独或混合使用。
可以将磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐用作磷源。此外，培养基还必须含有生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用基本生长促进剂如氨基酸和维生素。还可将适当的前体添加到所述培养基中。上述成分可以单批混合物的形式或在培养过程中适当地添加到培养物中。
通常在pH 5.5-9.0，尤其是pH 6.0-8.0的范围内进行发酵。可以适当的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水、或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。可以将适当的选择性作用物质例如抗生素添加到培养基中以维持质粒的稳定性。氧或含氧气体混合，例如空气，可通入培养物中以维持需氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃～40℃。持续培养直至L-氨基酸或L-苏氨酸形成最大量。这一目的通常在10～160小时的范围内达到。
可以通过如Spackman et al.(Analytical Chemistry 301190-1206(1958))中所述的阴离子交换层析继以茚三酮衍生化作用的方式，或通过如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))中所述的反相HPLC对L-氨基酸进行分析。
根据本发明的方法可用于发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸，尤其是L-苏氨酸。
根据布达佩斯条约将以下微生物保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ，不伦瑞克，德国)大肠杆菌菌株E.coli MG442，保藏号DSM 16574。
本发明借助于以下实施例得以更详述的阐述。
用于大肠杆菌的基本培养基(M9)和完全培养基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)所描述。将质粒DNA从大肠杆菌中分离及所用用于限制、连接、以及用Klenow磷酸酶和碱性磷酸酶处理的技术均如Sambrook et al.(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述技术进行。除非特别说明，大肠杆菌的转化按照Chung et al.(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 862172-2175(1989))所述方法进行。
制备菌株和转化体的温育温度为37℃。
实施例实施例1构建表达质粒pTrc99AyaaU使用聚合酶链反应(PCR)及合成寡核苷酸扩增大肠杆菌K12yaaU ORF。基于大肠杆菌K12 MG1655中的yaaU ORF的核苷酸序列(登录号AE000114)合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)，Blattner et al.(Science 2771453-1474(1997))。对引物序列进行修饰以形成识别位点用于限制性酶消化。选择EcoRI识别序列为yaaU-exl引物，选择BamHI识别序列为yaaU-ex2引物，这些序列在以下所示的核苷酸序列中带有下划线yaaU-ex15′-GATCTGAATTCTAAGGAATAACCATGCAACCGTC-3′(SEQ ID No.1)yaaU-ex25′-GATCTAGGATCCCAATTTACCCCATTCTCTGC-3′(SEQ ID No.2)使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)根据厂商的说明分离用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA。在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，Academic Press)，使用Vent DNA聚合酶(New England Biolaps GmbH，Frankfurt，Germany)和所述特异性引物可扩增到大小为约1371bp的DNA片段。
将扩增的yaaU片段根据厂商说明与载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero TOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Netherlands)连接并转化入大肠杆菌菌株TOP10中。在含50μg/ml卡拉霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，将载体用酶EcoRV和EcoRI切割，并在0.8％琼脂糖凝胶上检查该切割后，将该载体命名为pCRBluntyaaU。
然后用酶EcoRI和BamHI切割载体pCRBluntyaaU，并在0.8％琼脂糖凝胶上分离yaaU片段；然后将其从凝胶上分离(QIAquick GelExtraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)并与载体pTrc99A相连接(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，该载体已用酶BamHI和EcoRI消化。将大肠杆菌菌株XL1Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，USA)用连接混合物转化，并在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
分离质粒DNA后，通过用酶EcoRI/BamHI和EcoRV进行对照切割可以证明克隆成功的事实。
该质粒被命名为pTrc99AyaaU(图1)。
实施例2使用菌株MG442/pTrc99AyaaU制备L-苏氨酸生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442记载于专利说明书US-A-4,278,765中，该菌株被保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM，莫斯科，俄罗斯)，保藏号CMIM B-1628；并根据布达佩斯条约保藏于德国微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 16574。
用实施例1中所描述的表达质粒pTrc99AyaaU和载体pTrc99A转化菌株MG442，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。这生成了菌株MG442/pTrc99AyaaU和MG442/pTrc99A。然后将所选择的各个克隆在具有如下成分的基本培养基上进一步增殖3.5g/L Na2HPO4*2H2O、1.5g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl，0.1g/L MgSO4*7H2O、2g/L葡萄糖、20g/L琼脂和50mg/l氨苄青霉素。
在100ml锥形瓶中的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种具有如下成分的10ml预培养基2g/L酵母提取物、10g/L(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、0.5g/L MgSO4*7H2O、15g/LCaCO3、20g/L葡萄糖和50mg/l氨苄青霉素；并将混合物在来自Kühner AG ESR培养箱(Birsfelden，Switzerland)上，于37℃和180rpm温育16小时。将250μl这种预培养物接种到10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4*7H2O、0.03g/LFeSO4*7H2O、0.018g/L MnSO4*1H2O、30g/L CaCO3、20g/L葡萄糖和50mg/l氨苄青霉素)，并于37℃温育48小时。以相同的方式，但不添加氨苄青霉素到所述培养基中，检测起始菌株MG442所形成的L-苏氨酸。温育后，培养物上清液的光密度(OD)用Dr.Lange LP2W光度计(Düsseldorf，Germany)在660nm测定波长测定。
然后使用Eppendorf-BioTronik氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)，通过离子交换层析和包括茚三酮检测的柱后反应，测定已过滤灭菌的培养物上清中所生成的L-苏氨酸的浓度。
实验结果示于表1中。
表1
图1含有yaaU基因的质粒pTrc99AyaaU的图谱。
长度为近似值。所用缩写和名称具有如下含义·bla编码氨苄青霉素抗性的基因·lac Iq编码trc启动子抑制物蛋白的基因·trctrc启动子区域，IPTG-诱导型·yaaUyaaU基因的编码区·5S5S rRNA区域·rrnBTrRNA终止区用于限制性酶的缩写具有如下含义·BamHI来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens H)的限制性核酸内切酶·EcoRI来自大肠杆菌RY13的限制性核酸内切酶·EcoRV来自大肠杆菌B946的限制性核酸内切酶序列表<110>德古萨股份公司<120>使用肠杆菌科菌株制备L-氨基酸的方法<130>030321 BT<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>34<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(34)<223>yaaU-ex1<400>1gatctgaatt ctaaggaata accatgcaac cgtc34<210>2<211>32<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(32)<223>yaaU-ex2<400>2gatctaggat cccaatttac cccattctct gc32<210>3<211>1372<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
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<221>primer_bind<222>(1341)..(1372)<223>Primer yaaU-ex2<400>3gatctgaatt cttaaggaat aacc atg caa ccg tcc aga aac ttt gac gat51Met Gln Pro Ser Arg Asn Phe Asp Asp1 5ctc aaa ttc tcc tct att cac cgc cgc att ttg ctg tgg gga agc ggt99Leu Lys Phe Ser Ser Ile His Arg Arg Ile Leu Leu Trp Gly Ser Gly10 15 20 25ggt ccg ttt ctg gat ggt tat gta ctg gta atg att ggc gtg gcg ctg147Gly Pro Phe Leu Asp Gly Tyr Val Leu Val Met Ile Gly Val Ala Leu30 35 40gag caa ctg acg ccg gcg ctg aaa ctg gac gct gac tgg att ggc ttg195Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu Lys Leu Asp Ala Asp Trp Ile Gly Leu45 50 55ctg ggc gcg gga acg ctc gcc ggg ctg ttc gtt ggc aca tcg ctg ttt243
Leu Gly Ala Gly Thr Leu Ala Gly Leu Phe Val Gly Thr Ser Leu Phe60 65 70ggt tat att tcc gat aaa gtc gga cgg cgc aaa atg ttc ctc att gat291Gly Tyr Ile Ser Asp Lys Val Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Ile Asp75 80 85atc atc gcc atc ggc gtg ata tcg gtg gcg acg atg ttt gtt tca tcc339Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Ser90 95 100 105ccc gtc gaa ctg ttg gtg atg cgg gta ctt atc ggc att gtc atc ggt387Pro Val Glu Leu Leu Val Met Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly110 115 120gca gat tat ccc atc gcc acc tca atg atc acc gag ttc tcc agt acc435Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Ser Thr125 130 135cgt cag cgg gcg ttt tcc atc agc ttt att gcc gcg atg tgg tat gtc483Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val140 145 150ggc gcg acc tgt gcc gat ctg gtc ggc tac tgg ctt tat gat gtg gaa
531Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu155 160 165ggc ggc tgg cgc tgg atg ctg ggt agc gcg gcg atc ccc tgt ttg ttg579Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu170 175 180 185att ttg att ggt cga ttc gaa ctg cct gaa tct ccc cgc tgg tta tta627Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu190 195 200cgc aaa ggg cga gta aaa gag tgc gaa gag atg atg atc aaa ctg ttt675Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe205 210 215ggc gaa ccg gtg gct ttc gat gaa gag cag ccg cag caa acc cgt ttt723Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp Glu Glu Gln Pro Gln Gln Thr Arg Phe220 225 230cgc gat ctg ttt aat cgc cgc cat ttt cct ttt gtt ctg ttt gtt gcc771Arg Asp Leu Phe Asn Arg Arg His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala235 240 245
gcc atc tgg acc tgc cag gtg atc cca atg ttc gcc att tac acc ttt819Ala Ile Trp Thr Cys Gln Val Ile Pro Met Phe Ala Ile Tyr Thr Phe250 255 260 265ggc ccg caa atc gtt ggt ttg ttg gga ttg ggg gtt ggc aaa aac gcg867Gly Pro Gln Ile Val Gly Leu Leu Gly Leu Gly Val Gly Lys Asn Ala270 275 280gca cta ggg aat gtg gtg att agc ctg ttc ttt atg ctc ggc tgt att915Ala Leu Gly Asn Val Val Ile Ser Leu Phe Phe Met Leu Gly Cys Ile285 290 295ccg ccg atg ctg tgg tta aac act gcc gga cgg cgt cca ttg ttg att963Pro Pro Met Leu Trp Leu Asn Thr Ala Gly Arg Arg Pro Leu Leu Ile300 305 310ggc agc ttt gcc atg atg acg ctg gcg ctg gcg gtt ttg ggg cta atc1011Gly Ser Phe Ala Met Met Thr Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Ile315 320 325ccg gat atg ggg atc tgg ctg gta gtg atg gcc ttt gcg gtg tat gcc1059Pro Asp Met Gly Ile Trp Leu Val Val Met Ala Phe Ala Val Tyr Ala330 335 340 345
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430 435 440atg ggg taa attgggatcc tagatc1372Met Gly<210>4<211>443<212>PRT<213>Escherichia coli<400>4Met Gln Pro Ser Arg Asn Phe Asp Asp Leu Lys Phe Ser Ser Ile His1 5 10 15Arg Arg Ile Leu Leu Trp Gly Ser Gly Gly Pro Phe Leu Asp Gly Tyr20 25 30Val Leu Val Met Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu35 40 45Lys Leu Asp Ala Asp Trp Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Thr Leu Ala50 55 60Gly Leu Phe Val Gly Thr Ser Leu Phe Gly Tyr Ile Ser Asp Lys Val65 70 75 80Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Ile Asp Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile85 90 95Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Ser Pro Val Glu Leu Leu Val Met100 105 110Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr115 120 125Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Ser Thr Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile130 135 140
Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu145 150 155 160Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu180 185 190Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp210 215 220Glu Glu Gln Pro Gln Gln Thr Arg Phe Arg Asp Leu Phe Asn Arg Arg225 230 235 240His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala Ala Ile Trp Thr Cys Gln Val245 250 255Ile Pro Met Phe Ala Ile Tyr Thr Phe Gly Pro Gln Ile Val Gly Leu260 265 270Leu Gly Leu Gly Val Gly Lys Asn Ala Ala Leu Gly Asn Val Val Ile275 280 285Ser Leu Phe Phe Met Leu Gly Cys Ile Pro Pro Met Leu Trp Leu Asn290 295 300Thr Ala Gly Arg Arg Pro Leu Leu Ile Gly Ser Phe Ala Met Met Thr305 310 315 320Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Ile Pro Asp Met Gly Ile Trp Leu325 330 335Val Val Met Ala Phe Ala Val Tyr Ala Phe Phe Ser Gly Gly Pro Gly340 345 350Asn Leu Gln Trp Leu Tyr Pro Asn Glu Leu Phe Pro Thr Asp Ile Arg355 360 365Ala Ser Ala Val Gly Val Ile Met Ser Leu Ser Arg Ile Gly Thr Ile
370 375 380Val Ser Thr Trp Ala Leu Pro Ile Phe Ile Asn Asn Tyr Gly Ile Ser385 390 395 400Asn Thr Met Leu Met Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Gly Leu Leu Ile405 410 415Ser Val Ala Phe Ala Pro Glu Thr Arg Gly Met Ser Leu Ala Gln Thr420 425 430Ser Asn Met Thr Ile Arg Gly Gln Arg Met Gly435 440<210>5<211>1395<212>DNA<213>Shigella flexneri<220>
<221>CDS<222>(1)..(1395)<223>yaaU coding region<400>5atg caa ccg tcc aga aac ttt gac gat ctc aaa ttc tcc tct att cac48Met Gln Pro Ser Arg Asn Phe Asp Asp Leu Lys Phe Ser Ser Ile His1 5 10 15cgc cgc att ttg ctg tgg gga agc ggt ggt ccg ttt ctg gat ggt tat96Arg Arg Ile Leu Leu Trp Gly Ser Gly Gly Pro Phe Leu Asp Gly Tyr20 25 30gta ctg gta atg att ggc gtg gcg ctg gag caa ctg act ccg gcg ctg144Val Leu Val Met Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu35 40 45
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130 135 140agc ttt att gcc gcg atg tgg tat gtc ggc gcg acc tgc gcc gat ctg480Ser Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asp Leu145 150 155 160gtc ggc tac tgg ctt tat gat gtg gaa ggt ggt tgg cgc tgg atg ctg528Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Val Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175ggt agc gcg gcg atc cct tgt ttg ttg att ttg att ggt cga ttc gaa576Gly Ser Ala Ala Ile Pro Cys Leu Leu Ile Leu Ile Gly Arg Phe Glu180 185 190ctg cca gaa tct ccc cgc tgg tta tta cgc aaa ggg cga gta aaa gag624Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205tgc gaa gag atg atg ata aaa ctg ttt ggc gaa ccg gtg gct ttc gat672Cys Glu Glu Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Ala Phe Asp210 215 220gaa gag cag ccg cag caa acc cgt ttt cgc gat ctg ttt aat cgc cge720
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1008Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Leu Ile Pro Asp Met Gly Ile Trp Leu325 330 335gta gtg atg gcc ttt gcg gtg tat gcc ttt ttc tct ggc ggg ccg ggt1056Val Val Met Ala Phe Ala Val Tyr Ala Phe Phe Ser Gly Gly Pro Gly340 345 350aat ttg cag tgg ctc tat cct aat gaa ctc ttc ccg acg gat atc cgc1104Asn Leu Gln Trp Leu Tyr Pro Asn Glu Leu Phe Pro Thr Asp Ile Arg355 360 365gcc tct gcc gtg ggc gtg att atg tcc tta agt cgt att ggc acc att1152Ala Ser Ala Val Gly Val Ile Met Ser Leu Ser Arg Ile Gly Thr Ile370 375 380gtt tcg acc tgg gca ctg ccg ata ttt atc aat aat tac ggt atc agt1200Val Ser Thr Trp Ala Leu Pro Ile Phe Ile Asn Asn Tyr Gly Ile Ser385 390 395 400aac acg atg cta atg ggg gcg ggt atc tcg ctg ttt ggc ttg ttg att1248Asn Thr Met Leu Met Gly Ala Gly Ile Ser Leu Phe Gly Leu Leu Ile405 410 415
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20 25 30Val Leu Val Ile Ile Gly Val Ala Leu Glu Gln Leu Thr Pro Leu Leu35 40 45His Leu Asp Ala Glu Trp Ile Gly Ala Leu Gly Ala Ala Thr Leu Ala50 55 60Gly Leu Phe Ile Gly Thr Ser Leu Phe Gly Tyr Ile Cys Asp Lys Val65 70 75 80Gly Arg Arg Lys Met Phe Leu Leu Asp Ile Ile Ala Ile Gly Val Ile85 90 95Ser Val Ala Thr Met Phe Val Ser Thr Pro Leu Glu Leu Leu Val Met100 105 110Arg Val Leu Ile Gly Ile Val Ile Gly Ala Asp Tyr Pro Ile Ala Thr115 120 125Ser Met Ile Thr Glu Phe Ser Asn Thr Arg Gln Arg Ala Phe Ser Ile130 135 140Gly Phe Ile Ala Ala Met Trp Tyr Val Gly Ala Thr Cys Ala Asn Leu145 150 155 160Val Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Met Glu Gly Gly Trp Arg Trp Met Leu165 170 175Gly Ser Ala Phe Ile Pro Cys Leu Ile Ile Leu Ile Gly Arg Phe Asp180 185 190Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Leu Arg Lys Gly Arg Val Lys Glu195 200 205Cys Glu Gln Met Met Ile Lys Leu Phe Gly Glu Pro Val Cys Phe Asp210 215 220Asp Glu Leu Pro Gln Glu Thr Arg Phe Leu Gln Leu Phe Asn Arg Arg225 230 235 240His Phe Pro Phe Val Leu Phe Val Ala Ala Ile Trp Thr Cys Gln Val245 250 255
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1.含有增强的或过表达的yaaU ORF的肠杆菌科的重组微生物，其编码一种为推定的糖转运蛋白的多肽，且其以一种改良的方式生产L-氨基酸。
2.权利要求1所述的微生物，其中一种多核苷酸被增强，所述多核苷酸编码一种多肽，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性为至少90％。
3.权利要求2所述的微生物，特征在于其含有一种过表达的或增强的多核苷酸，所述多核苷酸对应于yaaU ORF并选自a)具有来自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遗传密码简并范围内对应于SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在严格条件下，与序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的互补序列杂交的序列的多核苷酸序列；和d)具有含有在功能上为中性意义的突变的序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的多核苷酸。
4.权利要求2所述的微生物，其特征在于所述多肽具有与选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的一种序列的相同性为至少95％的氨基酸序列。
5.权利要求2所述的微生物，其特征在于所述多肽具有与来自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8的氨基酸序列的相同性为100％的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项所述的微生物，其特征在于所述微生物是用含有所述yaaU ORF、该ORF的等位基因、或其部分、和/或启动子的载体，通过转化、转导或接合、或这些方法的组合而产生的。
7.权利要求1或6所述的微生物，其中所述yaaU ORF或所述等位基因的拷贝数增加至少一个拷贝。
8.权利要求7所述的微生物，其特征在于通过将所述ORF或所述等位基因掺入所述微生物的染色体而实现增加至少一个拷贝的yaaU ORF。
9.权利要求7所述的微生物，其特征在于通过在染色体外进行复制的载体实现增加至少一个拷贝的yaaU ORF。
10.权利要求1或2所述的微生物，其特征在于为了实现增强，a)位于所述yaaU ORF的上游的启动子和调节区域或核糖体结合位点是突变的；或b)表达盒或启动子被掺入所述yaaU ORF的上游。
11.权利要求1或2所述的微生物，其特征在于所述yaaU ORF位于增强所述基因表达的启动子的控制下。
12.权利要求1-11中任一项所述的微生物，其特征在于增强yaaU ORF使yaaU基因产物(蛋白质)的浓度或活性在亲代菌株或非yaaU ORF重组体微生物中的基因产物的活性或浓度的基础上增加至少10％。
13.权利要求1-12中任一项所述的微生物，其特征在于所需的L-氨基酸的生物合成代谢途径中的其它基因也以增强的尤其是过表达的形式存在。
14.权利要求13所述的微生物，其特征在于所述微生物选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。
15.权利要求1-14中任一项所述的微生物，其特征在于该微生物产生L-苏氨酸。
16.一种通过发酵肠杆菌科的重组微生物而生产L-氨基酸的方法，其特征在于a)在培养基中培养所需的L-氨基酸生产微生物，所述微生物中的yaaU ORF或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因被增强尤其是过表达，所述培养在所需L-氨基酸在培养基或细胞中富集的条件下进行；和b)分离所需的L-氨基酸，其中发酵液组分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分离的产物中或被完全除去。
17.权利要求16所述的方法，其特征在于使用权利要求1-15中任一项所述的微生物。
18.权利要求16或17所述的方法，其特征在于为了生产L-苏氨酸，发酵肠杆菌科的微生物，其中选自以下一组的一或多个基因被同时额外增强，尤其是过表达18.1至少一种编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的基因；18.2编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因；18.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因；18.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；18.5编码嘧啶转氢酶亚基的pntA和pntB基因；18.6编码介导高丝氨酸抗性的蛋白质的rhtB基因；18.7编码介导苏氨酸抗性的蛋白质的rhtC基因；18.8编码苏氨酸输出载体蛋白的谷氨酸棒杆菌的thrE基因；18.9编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因；18.10编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因；18.11编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因；18.12编码磷酸-组氨酸蛋白质己糖磷酸转移酶的ptsH基因；18.13编码磷酸转移酶系统的酶I的ptsI基因；18.14编码葡萄糖特异性IIA成分的crr基因；18.15编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因；18.16编码亮氨酸调节子的调节物的lrp基因；18.17编码fad调节子的调节物的fadR基因；18.18编码中心中间代谢的调节物的iclR基因；18.19编码烷基过氧化氢还原酶的小亚基的ahpC基因；18.20编码烷基过氧化氢还原酶的大亚基的ahpF基因；18.21编码半胱氨酸合酶A的cysK基因；18.22编码cys调节子的调节物的cysB基因；18.23编码NADPH亚硫酸还原酶黄素蛋白的cysJ基因；18.24编码NADPH亚硫酸还原酶血红素蛋白的cysI基因；18.25编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因；18.26编码具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseA基因；18.27编码sigmaE因子的全局调节物的rseC基因；18.28编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucA基因；18.29编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基的sucB基因；18.30编码琥珀酰-CoA合成酶的β亚基的sucC基因；18.31编码琥珀酰-CoA合成酶的α亚基的sucD基因；18.32编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因；18.33编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因；18.34编码sigmaE因子活性的调节物的rseB基因；和18.35大肠杆菌yodA可读框(ORF)的基因产物。
19.权利要求16-18中任一项所述的方法，其特征在于使用其中降低所需L-氨基酸的形成的代谢途径被至少部分弱化的微生物。
20.权利要求19所述的方法，其特征在于为了生产L-苏氨酸，发酵肠杆菌科的微生物，所述微生物中一或多个选自以下一组的基因被同时额外地弱化尤其是消除，或它们的表达被降低20.1编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因；20.2编码苹果酸脱氢酶的mdh基因；20.3大肠杆菌yjfA可读框(ORF)的基因产物；20.4大肠杆菌ytfP可读框(ORF)的基因产物；20.5编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因；20.6编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；20.7编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因；20.8编码果糖阻抑物的fruR基因；20.9编码sigma38因子的rpoS基因；和20.10编码天冬氨酸铵裂合酶的aspA基因。
21.权利要求16-20中任一项所述的方法，其特征在于制备选自L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸。
22.权利要求21述的方法，其特征在于制备选自L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸的L-氨基酸。
全文摘要
本发明涉及通过发酵肠杆菌科的重组微生物而生产L－氨基酸的方法，其特征在于a)在培养基中培养所需的L－氨基酸生产微生物，在所述微生物中可读框yaaU或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因被增强尤其是过表达，所述培养在所需L－氨基酸在培养基或细胞中富集的条件下进行；和b)分离所需的L－氨基酸，任选地，发酵液组分和/或生物量全部或部分(≥0至100％)保留在所分离的产物中或被完全除去。
文档编号C07K14/245GK1898392SQ200480038807
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月10日 优先权日2003年12月24日
发明者妮科尔·杜施 申请人:德古萨股份公司