专利名称：：表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌菌株及其构建方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体涉及表达头孢菌素脱乙酰酶的重组菌株及其构建方法。
背景技术：
：头孢菌素脱乙酰酶(EC,cephalosporinCdeacetylase，CE)可催化头孢菌素C、7-ACA及其衍生物脱乙酰化反应，其生成的产物用于制备半合成头孢菌素抗生素，如头孢呋辛z(cefuroxime)，S-1108等，在抗生素工业应用广泛。研究表明许多生物体中含有头孢菌素脱乙酰酶。例如柑桔皮、哺乳动物肝脏、枯草杆菌、带小棒链霉菌、顶头孢霉菌、诺卡氏菌、红酵母菌属和黑曲霉等(TakiraotoA，Takak眼T，TaniH，YagiS，MitsushimaK.2004.AppliedMicrobiologyandBiotechnology65:263-7)。日本盐野义制药(Shionogi)株式会社筛选到具有头孢菌素脱乙酰酶活性的枯草芽孢杆菌SHS0133，已在中国申请了发明专利(光岛健二，泷本明生，八木滋雄，园山高康，1998，由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法，CN98103932)。本发明创造性地采用基因重组技术构建了两株能高效表达头孢菌素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株，该菌株所产生的酶活性稳定，产率符合工业生产要求，目前，国内外尚未有该重组菌株及其构建方法的相关报道。
发明内容本发明的目的在于提供两株表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌。两株表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌转化有重组质粒pMM13S4和p醒1385，这两种重组质粒均以T7hc为启动子，且导入了头孢菌素脱乙酰酶基因和卡那霉素基因。两株重组大肠杆菌已于2007年11月15日提交保藏。保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国、武汉、武汉大学；其中大肠杆菌MM1384的保藏号为CCTCCNO:M207180，分类命名为大肠杆菌MM1384，Esc/zen'c/n'"co//MM1384;大肠杆菌MM1385的保藏编号为CCTCCNO:M207181，分类命名为大肠杆菌MM1385，Esc/zeWc//"co//MM1385。本发明的另一目的在于提供上述重组大肠杆菌郡株的构建方法，包括以下步骤1)设计两对引物，PCR扩增头孢菌素脱乙酰酶基因第一对引物上游引物CEF:5'—GGAATTCCy47M7^CAACTATTCGATCTGCCG—3',斜体为^flfeI酶切位点；下游引物CER1:5'—CCGOrfi4CGCCTTTMGATGCTGCTT—3'，斜体为i^ol酶切位点；第二对引物上游引物CEF:5'"GGMTTC<247}47^CAACTATTCGATCTGCCG—3'，斜体为I酶切位点，下游引物CER2:5'—CCG6TCfi^TCAGCCTTTAAGATGCTGCTT—3'，斜体为J力ol酶切位点。其中PCR扩增条件为，94°C，5min预变性；94°C，30s变性；59°C，30s退火;72°C，1.5min延伸，共29个循环后保持72°C，10min。2)筛选阳性克隆用Taq酶进行PCR产物加A反应，再与pMD18-T载体连接并转化宿主菌DH5ci，涂布LB平板，待转化子长出来后挑取转化子到LB培养基中培养，抽取质粒并进行酶切鉴定，挑取阳性克隆。3)构建重组质粒p醒1384和p醒1385;用#AI和i^ol双酶切鉴定阳性克隆，胶回收头孢菌素脱乙酰酶基因CE1、CE2;用I和化ol双酶切载体pET-24a(+)，胶回收载体片段；用T4连接酶连接头孢菌素脱乙酰酶基因片段和载体片段，得到重组质粒p腿1384和p固1385。4)构建表达头孢菌素脱乙酰酶的两株重组大肠杆菌将重组质粒导入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，构建成表达头孢菌素脱乙酰酶的诱导型大肠杆菌重组菌株。本发明创造性地采用基因重组技术构建了两株能高效表达头孢菌素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株，产生的酶活性稳定，产率符合工业生产要求，对于工业上大规模制备头孢菌素脱乙酰酶是十分有利的。两株重组大肠杆菌菌株是BL21(DE3)，来源于大肠杆菌K-12，GC含量是50.79%，[Riley，M.，Abe，T.，"^/.EscherichiacoliK—12:acoopera-tivelydevelopedannotationsnapshot-2005，NucleicAcidsRes.34(1)，卜9(2006)]，革兰氏染色阴性，两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5um0.8umX1.0um3.0um。具有周生鞭毛而能运动，不形成芽孢。由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37°C。在普通营养琼脂上表现的菌落形态光滑型,菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.88.0。图hPCR鉴定转化子的1X琼脂糖凝胶电泳图。泳道110为引物CEF，CER1扩增的DNA片段；泳道11为阳性对照；泳道12为阴性对照；泳道1316为引物CEF，CER2扩增的DNA片段。M为DNA分子量标签，由下至上分子量大小依次为0.25，0.50，0.75，1.0，1.5,2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，lO.Okb。图2:重组质粒p醒1384的图谱。图3:重组质粒pMM1385的图谱。图4:12%SDS-PAGE验证重组菌株MM1384和MM1385表达重组蛋白。泳道1、2、3依次为转化空载体PET-24a(+)的宿主菌BL21(DE3)总蛋白、上清和沉淀；泳道4、5、6依次为转化重组质粒pMM1384的宿主菌BL21(DE3)总蛋白、上清和沉淀；M为蛋白质中等分子量标签，分子量大小依次为116、66、45、35、25、18.4和14.4kDa;泳道7、8和9依次为转化重组质粒pMM1385的宿主菌BL21(DE3)总蛋白、上清和沉淀。具体实施例方式实施例1:表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌的构建及鉴定1、质粒构建1)质粒pET-24a(+):Novagen公司产品，大小为5.31kb，含有卡那霉素抗性基因，乳糖抑制子heI基因，启动子是T7hc，并具有多个限制性内切酶位点。质粒pMD18-T:TaKaRa公司产品，大小为2.7kb，含有氨苄青霉素抗性基因，启动子是^cZ基因，并具有多个限制性内切酶位点。枯草杆菌168购于枯草杆菌菌种保藏中心，大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)购于Novagen公司。2)以枯草杆菌168基因组作为模板，选用引物CEF，CER1和CEF，CER2分别扩增头孢菌素脱乙酰酶基因和622。PCR扩增的聚合酶为K0D，两个基因的扩增条件相同1)94°C，5min预变性；94°C，30s变性—2)59°C，30s退火一3)72°C，1.5min延伸，共29个循环一4)72°C，10min。PCR扩增产物胶回收，用Taq酶加A，加A的产物与pMD18-T载体连接，转化宿主菌DH5cl，挑取转化子到含有1%蛋白胨、0.5%酵母膏及1%氯化钠的LB液体培养基中，培养过夜，抽取质粒酶切鉴定筛选阳性克隆。抽取阳性克隆质粒，用A^eI和J力ol双酶切，胶回收DNA片段大小约950bp的头孢菌素脱乙酰酶基因和Gffi。用7fefeI和化oI双酶切载体pET-24a(+)，胶回收约5.3kb的DNA片段用T4连接酶连接头孢菌素脱乙酰酶基因片段或C皮和载体DNA片段，连接产物采用常规的化学转化法转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，涂布到含有1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化钠及1.5%琼脂粉的LB固体培养基上。2、重组菌株鉴定LB平板在37。C培养至长出转化子。用PCR方法检测转化子，上游引物CEF:5'-GGAATTC<^Z47^CAACTATTCGATCTGCCG-3'，下游引物CER1:5'-CCGHTfi^GCCTTTMGATGCTGCTT-3'，另一对引物是CEF和CER2，上游引物CEF:5'-GGMTTCCy47^7^CAACTATTCGATCTGCCG-3'，下游引物CER2:5'-CCGCTCfi^TCAGCCTTTAAGATGCTGCTT-3'，PCR扩增产物跑胶确定含有目的条带(见附图1)。挑取含有目的条带的重组菌送到上海英俊生物公司测序。确定表达带6个组氨酸的头孢菌素脱乙酰酶的诱导型大肠杆菌重组菌株是MM1384,(见附图2)，表达头孢菌素脱乙酰酶的诱导型大肠杆菌重组菌株是腿13S5(见附图3)。两株重组大肠杆菌(MM1384、MM1385)中分别含有的质粒pMM1384和pMM1385，它们的启动子是T77ac，质粒的抗性基因是卡那霉素基因。实施例2:重组菌株发酵及酶活力测定对表达头孢菌素脱乙酰酶的重组菌丽1384，MM1385进行摇瓶发酵，两种培养基配方如下TB培养基2.4%酵母膏，1.2%蛋白胨，0.4%甘油，磷酸缓冲液配制；LB培养基1%蛋白胨，0.5%酵母膏，lQ/^氯化钠，磷酸缓冲液配制。比较重组菌在不同培养基中的发酵效果，挑取腿1384和MM1385单菌落接种至4mL新鲜的LB液体培养基，卡那霉素终浓度是50ug/ml，37'C、220rpm培养过夜，按2%的接种量转接至30ml的TB和LB液体培养基中，37°C，220rpm培养至OD咖约1.0时，加入终浓度为1%的乳糖进行诱导，30°C，220rpm诱导6h和18h，分别收集菌体，测定头孢菌素脱乙酰酶的活力(见表1)。同时用12%SDS-PAGE验证重组菌株固1384和醒1385表达的重组蛋白(见附图4)表1两重组菌株发酵后头孢菌素脱乙酰酶活力测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上结果表明重组菌丽1384和麗1385在TB培养基中发酵产生头孢菌素脱乙酰酶的活力较高，符合工业生产需要。权利要求1、两株表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组菌株分别转化有重组质粒pMM1384和pMM1385，两种重组质粒均以T7lac为启动子，且含有头孢菌素脱乙酰酶基因和卡那霉素基因，两重组菌株保藏号分别为CCTCCM207180，M207181。2、一种构建权利要求1所述重组菌株的方法，包括以下步骤1)设计两对引物PCR扩增头孢菌素脱乙酰酶基因；2)筛选阳性克隆；3)构建重组质粒pMM1384和p醒1385;4)构建表达头孢菌素脱乙酰酶的两株诱导型大肠杆菌重组菌。3、根据权利要求2所述的构建重组菌株的方法，其特征在于用于PCR扩增的两对引物为第一对引物上游引物CEF:5'—GGAATTC"7^7^CAACTATTCGATCTGCCG—3'，斜体为A^/eI酶切位点；下游引物CER1:5'—CCG6T0^6"GCCTTTAAGATGCTGCTT—3'，斜体为酶切位点；第二对引物上游引物CEF:5'"GGAATTCC47^7161CAACTATTCGATCTGCCG—3'，斜体为A^eI酶切位点，下游引物CER2:5'~CCGC7Tfi^TCAGCCTTTAAGATGCTGCTT—3'，斜体为勘I酶切位点。4、根据权利要求2所述的构建重组菌株的方法，其特征在于PCR扩增条件为，94°C，5min预变性；94°C，30s变性；59°C，30s退火；72°C，L5min延伸，共29个循环后保持72°C，10min。全文摘要本发明提供了两株表达头孢菌素脱乙酰酶的重组大肠杆菌，用于构建重组菌的两种重组质粒均以T7lac为启动子，且含有头孢菌素脱乙酰酶基因和卡那霉素基因。该重组菌株的构建方法包括1)设计两对引物PCR扩增头孢菌素脱乙酰酶基因；2)筛选阳性克隆；3)构建重组质粒pMM1384和pMM1385；4)构建表达头孢菌素脱乙酰酶的两株诱导型大肠杆菌重组菌。本发明的重组菌株在抗生素制备工业具有广泛的应用前景。文档编号C12N15/60GK101555463SQ20081003102公开日2009年10月14日申请日期2008年4月8日优先权日2008年4月8日发明者曾红宇,晟杨,汪慧蓉,范文超,岗许,郑华宝申请人:中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心;湖南福来格生物技术有限公司