专利名称：一种用于重组工程的大肠杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株用于重组工程的大肠杆菌。
背景技术：
重组工程是指由重组酶催化的DNA短片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因 克隆或DNA改造的一种较为新颖的基因克隆手段。重组工程在常规基因克隆方法难以进行 或效率极低时有着极大的优势。例如当待克隆的DNA片段过大时，合适的酶切位点难以寻 找、凝胶回收难以进行、PCR扩增的得率低且易引入错配碱基；DNA片段经自外于照射等 操作也可能基因发生突变。重组工程则避免了这些操作步骤，已逐渐成为常规的克隆手段。 重组工程中的重组酶主要是来源自Wl菌体三个基因，其中reda(exo)编码DNA5'端至 3'端的外切酶，其作用于双链DNA分子而产生3'端突出的分子；re邻(bet)编码单链结合蛋 白，其结合在DNA分子的3'突出端而防止大肠杆菌所产生的DNA内切酶RecBCD对外源 DNA的降解，同时还行使重组酶活性，即促进两个单链、同源DNA分子之间的退火；gam 基因的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解。这三个基因也就是通常意义上的 重组酶基因。
目前主要有两种重组工程系统，即两种重组酶存在和受诱导的形式。第一种是重组酶 基因克隆在质粒上的，如美国Purdue大学Barry Wanner教授实验室所构建的pKD46载体和 德国Dresden大学Youming Zhang博士等构建的pSC101-BAD-gbaA载体。这两个质粒的 共同点是l.由reda， re邻和gam由pBAD启动子所驱动，pBAD启动子受L-阿拉伯糖诱 导表达的araC基因所激活。2.质粒的复制子为来源于pSC101的温度敏感性复制子，此复制 子在30°C行使复制功能，在37°C或更高温度时质粒不再复制而丢失。两个质粒的不同点 是l.pKD46含有orf60a基因而pSC101-BAD-gbaA含有大肠杆菌来源的recA基因，这两 个基因都可以可促进同源重组的效率。常规的大肠杆菌的克隆宿主菌如DH10B是recA基 因缺陷型的以避免基因克隆中的异常重组。重组工程系统中的recA基因是瞬时诱导表达的， 故不会产生异常的重组。2.pKD46是氨苄青霉素抗性的，而pSC101-BAD-gbaA是四环素抗 性的。
第二种系统是美国国立癌症研究所Donald Court实验室构建的大肠杆菌DY380。DY380中的redcc, red和gam基因包含在缺陷前噬菌体中，此缺陷前噬菌体以整合至大肠杆菌基 因组的形式存在。reda， red(3和gam基因由PL启动子所诱导。32°C时，PL启动子被温度 敏感性抑制子cI857所抑制，42T时抑制解除。因此在DY380中，重组酶的表达是由32°C 转移至42。C时的热所诱导的。
这两个系统都有些缺点，首先它们均是在30°C时生长，而大肠杆菌的最适温度是37°C， 这样菌株的生长较慢；其次，含重组酶的质粒在重组发生后，在37°C下也不完全丢失，这 样就对重组克隆的分离带来困难。这常常需要将重组产物再次转化以去除含重组酶的质粒， 而这在进行细菌人工染色体(BAC)的操作时，会带来麻烦，因为BAC较大(其克隆片段可 达300kb)，反复转化(在多次修饰时)就可能对DNA有所伤害。对BAC的操作是重组工 程的优越点所在，也是经常要进行的。而整合型的DY380需要42。C水浴进行15分钟的热 诱导，这就增加了额外的操作，主要的是保持温度均匀有时难以控制。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株重组工程菌，该菌株是将重组酶基因(reda， re邻 和gam)以及相关的araC， pBAD， recA和庆大霉素抗性基因(Gm)—起在同源重组下，整 合至大肠杆菌DH10B的基因组上的endA基因区域而获得了 。
大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192是通过以下方法获得将行使重组工程的基因片段，即 包含来源于大肠杆菌的阿拉伯糖操纵元的调节基因araC，阿拉伯糖操纵元的启动子pBAD， 来源于X噬菌体的重组酶基因reda、 red P和gam，来源于大肠杆菌recA基因和庆大霉素抗 性基因(Gm)， 一起整合至大肠杆菌DH10B的基因组中的endA基因区域而获得。其中redoc， re邻，gam和recA由pBAD启动子所驱动。当在培养基中加入L-阿拉伯糖时，pBAD驱动 reda, re邻，gam和recA的表达，此时可催化DNA短片段之间的同源重组，即重组工程。 DNA短片段的长度一般在50个碱基对。
本发明的大肠杆菌工程菌中，reda, re邻和gam和recA基因受pBAD启动子所驱动。 pBAD启动子受araC基因所调节，araC基因在L-阿拉伯糖存在时才发挥调节功能。reda， re邻和gam和recA基因在受pBAD启动子驱动表达后，催化短DNA片段之间的同源重组， 即重组工程。araC， pBAD， redct， redf3， gam和recA基因，整合至大肠杆菌DH10B基因 组中的endA基因区域，endA 基因被去除。庆大霉素抗性基因Gm和araC， pBAD, reda， re邻，gam和recA基因连接
4在一起，作为基因整合菌株的筛选标记。
尽管所整合的DNA片段中含有recA基因，可行使同源重组的功能，但为了增加效率， 我们采用pSC101-BAD-gbaA进行同源重组。同时，虽然pSC101-BAD-gbaA所催化的重组 工程系统可以利用短至50个碱基对的同源臂进行同源重组，但重组酶及其相关部分较大 (5.8kb)， PCR扩增的效率低，更有可能引起碱基错配而使基因突变。这样为保险起见，我 们使用较长的DNA片段(本发明中实际使用左侧140bp和右侧370bp作为同源片段进行同 源重组)。
所选择的整合位点为endA基因区域，endA基因是DNA专一性内切酶，其降解DNA 而损伤DNA的质量，故在大肠杆菌DH10B中是点突变而失去活性的，本发明扩增其两侧 的DNA作为同源片段以进行同源重组后，将重组酶基因部分整合至基因组，endA基因部 分被去除。
按上述方法构建的一株具体的菌株是大肠埃希氏菌CEscA^r/z/fl co//) CGMCC No. 3192。该 菌株含有来源于X噬菌体的重组酶基因reda, re邻和gam和来源于大肠杆菌recA基因。 从实施例中以大肠杆菌LS-GR进行同源重组实验的结果可得如下结论
1. 尽管在中等拷贝数的质粒修饰实验中，直接涂布转化液所得到的单倍体正确克隆的比例 较小(1/22)，但培养数小时培养后提质粒再转化可得到80%(8/10)的正确率。由于是中等 拷贝数的质粒，其克隆的片段不会大(一般在数kb至十几kb)，因此反复转化不会对DNA 有损害。
2. 对单拷贝的、重组工程中经常使用的BAC载体，直接涂布转化液所得到正确克隆比例高 (6/8)。转化后培养再提质粒转化，可得到100%的效率(8/8)，但这没有必要， 一方面是 增加了时间，另一方面，转化含大片段DNA的BAC可能对DNA有所伤害。直接涂布 转化液筛选正确的克隆已足够。
本菌株的优点在于l.可在37°C，不加抗生素下培养，生长迅速；2.以L-阿拉伯糖进 行诱导，简便易行；3.无任何残留质粒的干扰；4.同源重组的效率高，尤其是针对重组工程 中常见的BAC载体的效率高。本发明所得菌株可成为重组工程的通用菌株。
图1是重组酶及其相关基因克隆后所得到的质粒pGR的图谱。 其中
707-1126是endA基因左侧420 bp的同源片段，实际使用的是其中 PvuII-XhoI之间的170bp作为同源重组的片段；1198-1731是3'端至5'端方向的庆大霉素抗性基因的开放阅读框；1968-2846是3'端至5'端方向的阿拉伯糖操作元调节基因araC;3022-3149是阿拉伯糖操作元的启动子pBAD;3192-3608是来源于X噬菌体的gam基因；3614-4399是来源于X噬菌体的reda基因；4402-5076是来源于Wl菌体的re邻基因；5100-6161是大肠杆菌中的recA基因；6949-7616是3'端至5'端方向的载体复制区colEl;7764-8624是3'端至5'端方向的氨苄青霉素抗性基因的开放阅读框；6170-6550是endA基因右370bp的同源片段。图2是pGR以不同限制性内切酶进行酶切的琼脂糖凝胶电泳图。
1. DL2000分子量禾示准:2.0，1.0,0.75，0.5,0.25,0.1 kb
2. XDNA/Hindlll分子量标准:23.1,9.4,6.6,4.4,2.3，2.0 kb
3. pGR7EcoRI: 0.7,1.2， 1.4,5.3 kb
4. pGR/EcoRV:0.2,1.04,3.0,4.54 kb
5. pGR/PvuII:0.44,2.51,5.8 kb
6. pGR/XhoI-BamHI/0.42，2.0，2.2,3.0 kb
7. pGR//NcoI-KpnI:2.0，2.4,4.3 kb
8. DL500分子量丰示准:5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0,1.5,1.0,0.5,0.25 kb图3是大肠杆菌LS-GR基因组上重组酶等基因的位置图。
其中KI4和KG， KB和KE和KA和KI1等是验证大肠杆菌LS-GR基因型的PCR引物。图4是本发明中重组工程实例的示意图。
其中neo是卡那霉素抗性基因，kan是卡那霉素。HA1是与待修饰的质粒plasmid 1上一端序列相同的同源臂，5'是针对与卡那霉素5'的引物部分，整个引物是由HA1和5'的序列所组成;HA2是与待修饰的质粒plasmid 1上另一端序列相同的同源臂，3'是针对与卡那霉素3'的引物部分，整个引物是由HA2和3'的序列所组成。扩增产物转化至含有plasmidl的大肠杆菌LS-GR中，经过同源重组，在卡那霉素抗性的筛选之下，得到经修饰的质粒plasmid 2。图5是pACYC184的质粒图谱。图6是pAEN的质粒图谱。
6图7是大肠杆菌LS-GR介导将pACYC184上的四环素抗性基因(Tc)置换为卡 那霉素抗性基因(neo)的同源重组实验中，从转化液直接涂布抗性平板上，所得的单菌落 提取的pAEN质粒电泳检测结果。 l-22.为随机获得的22个克隆质粒电泳 M.pACYC184
可见第1，6,9,12，15，17，19，20，21，22号克隆为单倍体质粒带型，其余均为质粒多倍体带型。 图8是图7中所获得的质粒以Ncol进行酶切的结果。
M: DL500分子量标准:5.0，4.0，3.5，3.0，2.5,2.0，1.5，1.0，0.5,0.25 kb
可见只有第19号克隆为重组质粒pAEN单体，Ncol进行酶切得到1.4 kb和2.5 kb两条 带，而其余克隆均含有pACYC184，即多出一条4.2kb的条带。 图9是以大肠杆菌LS-GR将pACYC184上的四环素抗性基因(Tc)置换为卡 那霉素抗性基因(neo)的同源重组实验中，电转化后，培养，提质粒再转化DH10B 所得单菌落，所提取的质粒电泳的检测结果。 M. pACYC184
l-10.为随机获得的10个克隆质粒电泳，其中第6和第7号克隆为多倍体。
图10是图9所获得的质粒以Ncol进行酶切的结果。
M: DL500分子量丰示准:5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0,1.5,1.0，0.5，0.25 kb
卜IO.酶切显示pAEN以Ncol进行酶切所得的1.4 kb和2.5 kb两条带，而第6和第7号克
隆含有pACYC184，即多出一个4,2kb的条带。 图11是图9所获得的质粒以Sphl和Xbal双酶切的结果。 M: DL500分子量木示准:5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0，1.5,1.0，0.5,0.25 kb
卜IO.酶切显示pAEN以Sphl和Xbal双酶切所得的0.8 kb和3.1 kb两条带，而第6和第7
号克隆含有pACYC184，即多出0.6kb和3.6kb两条带。 图12是pECBACl的质粒图谱。 图13是pBACN的质粒图谱。
图14是以大肠杆菌LS-GR将pECBAC氯霉素抗性基因(Cm)置换为卡那霉素抗性基因 (neo)的同源重组实验中，转化液直接涂布所得的单菌落提取的pBACN质粒及电转化后， 培养，提质粒再转化至￡ )//011108所得单菌落，所提取的质粒电泳的检测结果。 1-8.从转化液直接涂布所得的单菌落中随机挑取的8个提取的pBACN质粒 M.pECBACl9-16.再转化￡.co// DH10B所得单菌落中随机挑取的8个提取的pBACN质粒图15是图14所得质粒的Ncol酶切的结果。
1-8.是图14中1-8质粒Ncol酶切的结果，pBACN酶切得到2.5 kb和5.3 kb两条带，第3
号和第7号克隆含有pECBACl单体，即多出1.9 kb和5.6kb两条带(5.6 kb和pBACN酶
切得到的5.3kb不能分开)。
M1.DL2000分子量标准:2.0,1.0，0.75，0.5,0.25,0.1 kb
M2. XDNA/Hindlll分子量木示准:23.1，9.4，6.6,4.4，2.3，2.0kb
9-16.是图14中9-16质粒NcoI酶切的结果，均显示正确的pBACN酶切所得到的2.5kb和5.3kb两条带
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明中所述大肠杆菌LS-GR于2009年7月10日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；保藏菌株分类命名为大肠埃希氏菌(Esc/ieArWflco//)，保藏编号CGMCC No 3192.实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒
1. ￡ic/rer/cA/a co// DH10B 。 基因型 F wcrA A(Awr-;m/RMS-mcTBC)(()80d/。cZAM15 A/acX74 cfeoR wcAl araD139A(ara, /ew)7697 ga/U ga/K r/wL e"fi Al聰; G.。文献Life Technologies, Inc. Focus (1990)12,19。购自美国Invitrogen公司。
2. pBluescript KS(誦)。文献Alting-Mees, M.A. and Short, J.M. (1989) pBluescript II: genemapping vectors. Nucleic Acids Res， 17,9494。购自美国Novagen公司。
3. pACYC184。文献Chang, A.C. and Cohen， S.N. (1978) Construction and characterization ofamplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the PI 5A cryptic miniplasmid. JBacteriol， 134， 1141-1156。购自美国NEB公司。4. pGEM-T easy ，购自美国Promega公司。
5. pSC101-BAD-gbaA。文献Wang， J" Sarov， M.， Rientjes, J" Fu， J" Hollak， H" Kranz， H.， Xie, W.， Stewart, A.F. and Zhang, Y. (2006) An improved recombineering approach by adding RecA to lambda Red recombination. Mol Biotechnol， 32,43-53 。来自德国Dresden大学的Youming Zhang博士
6. pKD46和pKD4。文献Datsenko， K.A. and Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A， 97， 6640-6645 。来自美国Purdue大学Barry Wanner的教授。
7. pECBACl 。文献Frijters,A.C丄，Zhang ，Z., Damme van. M., Wang,GL.，Ronald. PC. and Michelmore RW. (1997)Constraction of a bacterial artificial chromosome library containing large EcoRI and HindIII genomic fragments of lettuce. Theor Appl Genet ，94,390-399。来自美 国University of California, Davis的Richard Michelmore教授。
8. pBAD322G。文献Cronan， J.E. (2006) A family of arabinose曙inducible Escherichia coli expression vectors having pBR322 copy control. Plasmid， 55， 152-157。来自美国University of Illinois at Urbana隱Champaign的John Cronan教授。
实施例l
本发明大肠杆菌LS-GR构建的过程如下
l.大肠杆菌DH10B的电转化感受态的制备和DNA转化
自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至2ml LB液体培养基中37°C振荡过夜，以1/50体 积转至50mlLB,振荡培养至菌体OD6(K)约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟， 4°C， 5000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200 ^的10% 甘油中，50pl每管分装。
将DNA加至50ixl冰上融化的DH10B的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转 移至冰上预冷的lmm电转杯中，电击转化。电转化条件lmm电转杯，200Q， 1800 V， Bio-Rad公司GenePulserllR电转化仪。加lml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液 转移至一个无菌的1.5mleppendorf管中，37°C或30°C振荡培养60分钟后，转化液涂布在 相应抗生素的抗性平板上，37°C或30°C培养。挑取单菌落，在含相应抗生素的液体培养 基中培养，提取质粒，酶切和测序鉴定。2. Gm抗性基因克隆至DBluescript KS"得到PKAG
将pBAD322G和pBluescript KS(-)均以Sacl酶切，割胶回收0.8 kb的Gm片段和3.0 kb的pBluescript KS/SacI片段，以T4连接酶在16°C连接过夜，连接液转化五.co// DH10B感受态细胞，转化液涂布含50 pg/ml硫酸庆大霉素，30 |ag/ml IPTG和40 pg/ml XGal的LB固体平板，挑取白色菌落，37°C培养过夜。提取质粒酶切，测序验证，正确的克隆命名为pKAG。
3. 将Gm抗性基因和PKD46的araC基因克隆至DBhiescriut KS(-、得到dGAC
设计引物
GRK1:5'陽GGGCTCGAG GCGGCGTTGTGACAATTTACCG-3' , (SEQ ID NO. 1)GRK2: 5'-GGGGAGCTCGAATTGACATAAGCCTG-3'， (SEQ ID N0.2)分别在5'端引入XhoI位点，在3'端保留SacI位点(以下划线表示)，以pKAG为模板，PCR扩增0.8kb的Gm片段，乙醇沉淀回收后以XhoI和SacI酶切后，割胶回收。设计引物
GRK3: 5'隱GGGGAGCTC CATCGATTTATTATGACAACTTGACGGC-3' ， ( SEQ ID N0.3 )GRK4: 5'-GGG GGATCCGCTAATCTTATGGATAAAAATG-3'， (SEQ ID N0.4)分别在5'端和3'端引入SacI和BamHI位点(以下划线表示)，以pKD46为模板，PCR
扩增U kb的araC片段，以Sacl和BamHI酶切后，割胶回收。
将酶切回收的Gm片段，araC片段与以Xhol和BamHI酶切的pBluescript KS(-)三片段
连接，转化五.co// DH10B感受态细胞，转化液涂布含100 pg/ml氨苄青霉素,30 pg/ml IPTG
和40pg/mlXGal的LB固体平板，挑取白色菌落，37。C培养过夜。提取质粒酶切验证，测
序正确后，得到克隆pGAC。
4. endA基因两端同源臂克隆到DBluescript KS"得到pENLR
以￡. o /fDH10B基因组为模板，设计引物
EA1: 5'-GGGGAATTCGCACGAACTGGCACATTTGCTGG-3' ， ( SEQ ID NO.5 )EA2: 5'-GGGCTCGAGGGAAAATGCTGCGCTCAGTAC-3', (SEQ ID N0.6 )分别在5'端和3'端引入EcoRI和Xhol位点(以下划线表示)。PCR扩增420 bp的DNA片段，乙醇沉淀沉淀回收后以EcoRI和XhoI酶切，割胶回收。
EA3: 5'-GGGCTCGAGATCATAACCCGTATGTGCAAC-3', ( SEQ ID NO.7)
10EA4: 5'-GGGGGTACCGGTGAATATGCAGCGGAGATTC-3' ， ( SEQ ID N0.8 )分别在5'端和3'端引入XhoI和Kpnl位点(以下划线表示)。PCR扩增370bp的DNA
片段，乙醇沉淀沉淀回收后以XhoI和KpnI酶切，割胶回收。
将酶切回收后的两个片段与以EcoRI和Kpnl酶切的pBluescript KS(-)进行三片段连接，
转化co// DH10B感受态细胞，转化液涂布含100 pg/ml氨苄青霉素，30 pg/ml IPTG和
40吗/mlXGal的LB固体平板，挑取白色菌落，37。C培养过夜。提取质粒酶切验证，测序
正确后，得到克隆pENLR。
以上50ulPCR反应体系
dd H205pllOXPCR反应缓冲液1.3|il 10mMdNTP1.5pl上游引物(终浓度0.75mM)1.5)^1下游引物(终浓度0.75mM)2pl模板(质粒 100ng，基因组DNA 200ng)0.5^1 pfU聚合酶(5U/jxl)
PCR反应条件95。C变性5分钟，(95。C45秒，60GC 1分钟，72°C lkb每分钟)，共34个循环，72°C延伸10分钟。使用仪器为Bio-rad公司的PTC-200型号的PCR仪。反应结束后，以加入20 pg/ml的溴化乙锭(EB)的1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 重组酶基因gam, reda， redB和recA基因克隆到nBluescriDt KS(-)得到dGBAR
将pSC101-BAD-gbaA以BamHI和Xhol酶切，割胶回收3.1 kb的片段，克与BamHI和Xhol酶切的pBluescript KS(-)相连，转化￡ co/!' DH10B感受态细胞，
转化液涂布含100pg/ml氨苄青霉素的LB固体平板，挑取菌落，37°<:培养过夜。提取质粒酶切酶切，测序正确后，得到pGBAR。
6. 重组酶基因gam, reda， redB及相关基因克隆得到dGR
将质粒pGAC用XhoI-BamHI酶切，割胶回收2.0 kb的片段；pGBAR用BamHI和Xhol酶切，割胶回收3.1 kb的片段。将这两个片段与XhoI酶切的pENLR相连，转化E co//DH10B感受态细胞，转化液涂布含100 ng/ml氨苄青霉素和50 pg/ml硫酸庆大霉素的LB固体平板，挑取菌落，37。C培养过夜。提取质粒酶切验证正确后，得到质粒pGR(图l)。 pGR的酶切 结果见图2。
7. 大肠杆菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA电转化感受态的制备
首先将pSC101-BAD-gbaA如步骤1中方法转化至大肠杆DH10B中，在30°C培养和四 环素终浓度为10 ng/ml条件下筛选，所得菌株为大肠杆菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA。
将在-7(^C冻存的菌株划线于四环素10 pg/m的LB抗性平板，30°C培养20小时以上。 挑取单菌落至2ml含四环素10 pg/ml的LB液体培养基，于30°C振荡培养过夜，按1/50 的体积转接至20ml同样的培养基，30°C振荡培养，至OD6oo为0.2时，加入终浓度为0.15% 的L-阿拉伯糖，37°C振荡培养约1小时，OD6oo为0.3 0.4之间。将菌体冰浴10分钟，4°C， 5000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于100 pl的10%甘 油中，每管50pl分装。
8. 重组工程法构建菌株大肠杆菌LS-GR
提取pGR质粒，以PvuII酶切，割胶回收5.8 kb的片段，为了消除环状质粒转化时带 来的背景干扰，酶切回收的片段进行第二次PvuII酶切，并割胶回收。以上两次割胶回收都 是使用无EB的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为25 V，时间是12小时。回收片段后以1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，调整DNA浓度为200ng/p1.
将300 ng的5.8 kb DNA片段，加入到新鲜制备的大肠杆菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA 电转化感受态中，枪头轻轻吹打混匀。混合液转移至冰上预冷的电转杯中，电击转化。电 转化条件1 mm电转杯，200Q, 1800v， Bio-Rad公司Gene Pulser IIR电转化仪。加1 ml LB 液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5mleppendorf管中，37°C振 荡培养70分钟后，转化液涂布于含50pg/ml的硫酸庆大霉素的抗性平板上，37。C培养20 小时，挑取长出的菌落进行验证。
9. 大肠杆菌LS-GR的获得
随机挑取步骤9中获得的4个菌落，在含50 pg/ml硫酸庆大霉素的LB液体培养基中 于37。C培养三代，菌体稀释后涂布在含50ng/ml硫酸庆大霉素的LB固体平板上，随机挑 取100个菌落，分别影印至50 ng/ml硫酸庆大霉素的LB固体平板上和含10 pg/ml四环素 的LB抗性平板上，分别在37°C和30°C培养，结果发现菌落在含50 ng/ml硫酸庆大霉素的LB固体平板上生长良好，而在含l(^g/ml四环素的LB抗性平板上不生长，表明菌株中不再有pSC101-BAD-gbaA。验证pSC101-BAD-gbaA不再存在至关重要，因为残留的pSC101-BAD-gbaA可表现出重组酶的活性，这样就可对目的菌株产生干扰。
为进一步确证pSC101-BAD-gbaA的丢失，随机挑取4个菌落，在含50 ng/ml硫酸庆大霉素的LB液体培养后，提质粒，电泳后发现菌株不含质粒。
将这4个菌株，进行菌落PCR验证，设计扩增pSC101-BAD-gbaA复制子repA区域的引物如下
repAl: 5'-ATGTCTGAATTAGTTGTTTTC-3' (SEQ ID N0.9)repA2: 5'-CAACGTATCAGTCGGGCGGCC-3' (SEQ ID NO.10)
以大肠杆菌DH10B/pSC101-BAD-gba的菌落PCR为对照，对照可扩增出0.4kb的repA片段，而所选择的4个菌株未扩增出产物。
综合抗性验证、质粒提取和PCR验证，我们确认菌株中已不再含有pSC101-BAD-gbaA。最终，随机选取一个菌株命名为大肠杆菌LS-GR。
10.大肠杆菌LS-GR中重组酶等基因的整合状态的PCR和克隆、测序验证根据预期的基因在基因组上的整合状态，设计三对引物KI4: 5'-GTTCGATCGATTTCTGGATAG-3' (SEQ ID NO. 11)KG: 5'-GGTCGATGTTTGATGTTATGG-3' (SEQ ID N0.12)KB: 5'-CGACCCACAGGAACTGATCAC-3' (SEQIDN0.13)KE: 5'-ATTCAAACAGGGTTCTGGCGTC-3' (SEQIDN0.14)KA: 5'-TCTCACATGGGCCTTGCGGCAC-3' (SEQIDN0.15)KI1: 5'-ATGAAATTCGCCTCAATCCCG國3' (SEQIDN0.16)
其中，KI4位于基因组上整合位点的上游外部，KG位于Gm部分；KB位于re邻部分，KE位于redoc部分；KA位于recA部分，KI1位于的基因组上整合位点的下游外部。
以大肠杆菌LS-GR的菌落为模板，以Takara公司的Ext叫进行PCR扩增，三对引物(KI4和KG， KB和KE, KA和KIl)均可扩增出1.0 kb的目的片段。将这三个片段克隆在pGEM-T easy载体上，测序发现序列与预期完全一致。这就证明了大肠杆菌LS-GR中的基因型，如图3所示。实施例2:
如图4的实验流程示意图所示，本专利为检验大肠杆菌LS-GR的重组工程的功能，将 含中等拷贝数的pl5A复制子的质粒pACYC184 (图5)上的四环素抗性基因(Tc)置换为 卡那霉素抗性基因(neo),得到的新质粒命名为pAEN (图6)。
1. 带同源臂的卡那霉素抗性基因(neo)的扩增
设计引物
AEN1:5'-ATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTATG GACAGCAAGCGAACCGG-3' (SEQ ID NO. 17)
AEN2:5'-TTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCTCA GAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO. 18)
引物前面50个碱基是pACYC184质粒上Tc基因两端的同源臂(下划线表示)，后面的 碱基是pKD4质粒上neo基因两端部分。
以pKD4模板，PCR扩增0.8kb的neo基因，1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物沉 淀回收，调节DNA浓度为200ng/jil。
2. 诱导重组酶表达的电转化感受态细胞的制备
首先将pACYC184以上述常规方法转化至大肠杆菌LS-GR，以含25 pg/ml氯霉素的 LB固体平板筛选，所得菌株命名为LS-GR/ pACYC184。制备重组酶表达的 LS-GR/pACYC184电转化感受态细胞的方法如下挑取单菌落至含25 ng/ml氯霉素的LB 液体培养基中，220 rpm， 37°C培养16个小时。菌液以1/50的比例接种到100 ml的氯霉 素25 pg/ml的LB液体培养基中，37°C， 220rpm培养约2.5小时，测量OD柳在0.2到0.3 之间。加入终浓度为10 mM的L-阿拉伯糖，37°C， 220 rpm诱导培养1小时。将菌体冰 浴10分钟后，4°C， 5，000rpm离心5分钟，弃上清。以预冷的10%甘油洗涤沉淀两次，最 后悬浮于300^1的预冷的10%甘油中，每管5(^1分装。
3. 大肠杆菌LS-GR介导的同源重组
取200ng的neo PCR产物，加入到新鲜制备的重组酶表达的￡.co/f LS-GR/pACYC184 电转化感受态中，枪头轻轻吹打混匀。混合液转移至冰上预冷的电转杯中，电击转化。 电转化条件lmm电转杯，200Q， 1800v， Bio-Rad公司GenePulserIIR电转化仪。力BlmlLB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5mleppendorf管中，37°C振荡培养70分钟后。
(1) 取0.1ml转化液直接涂布与含30^ig/ml卡那霉素的LB平板，37。C培养20小时，挑取单菌落培养，提质粒酶切验证。质粒电泳结果见图7，酶切验证结果见图8。
(2) 取0.5ml菌液接至3.0ml含30 ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养8个小时，提取质粒，转化至fi.coZ!'DH10B中，涂布至含3(Hig/ml卡那霉素的LB平板。挑取单菌落培养，提质粒酶切验证。质粒电泳结果见图9,酶切验证结果见图10和图11。
试验结果
(l)O.lml转化液直接涂布平板，长出的菌落数平均为196个。随机挑取22个菌株进行质粒验证，发现有9个菌株中提取的质粒是正确的单倍体，其他13个是多倍体质粒。将这9个质粒用Ncol酶切验证，发现仅有一个质粒是pAEN单体，其它的质粒为pACYC184和pAEN的混合质粒。
(2)从转化至￡.co// DH10B的平板上随机挑取10个菌落提取质粒验证发现有8个是正确的单倍体，使用Ncol以及Xbal和Sphl双酶切验证，证明这8个质粒全部是pAEN，没有pACYC184混在其中。
实施例3:
利用大肠杆菌LS-GR的重组工程的功能，将单拷贝质粒pECBACl (图12)氯霉素抗性基因(Cm)置换为卡那霉素抗性基因(neo)，得到的新质粒命名为pBACN (图13)。
l.带同源臂的卡那霉素抗性基因(neo)的扩增设计引物
CEN1:5'-TAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT￡TATGGACAGCAAGCGAACCGG-3' (SEQ ID NO. 19 )
CEN2:5'-GCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO.20)
引物前面50个碱基是pECBACl质粒上Cm基因两端的同源臂(下划线表示)，后面的碱基是pKD4质粒上neo基因两端部分。以pKD4模板，PCR扩增0.8kb的neo基因，1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物沉淀 回收，调节DNA浓度为200 ngVl。
2. 诱导重组酶表达的电转化感受态细胞的制备
首先将pECBACl以上述常规方法转化至大肠杆菌LS-GR，以含12.5 pg/ml氯霉素的 LB平板筛选，所得菌株命名为￡.co/!' LS-GR/ pECBACl 。制备重组酶表达的￡.co// LS-GR/ pECBACl方法同实例2。
3. 大肠杆菌LS-GR介导的同源重组
DNA转化和筛选的方法同实例2。试验结果
(1) 0.1ml转化液直接涂布平板，长出的菌落数平均为121个，随机挑取8个菌株挑取进行 质粒验证，发现有6个菌株中提取的质粒是正确的单倍体，其他2个异常。质粒电泳结 果见图14。将这8个质粒用NcoI酶切验证，发现都为正确的pCEN单体，2个异常的为 pBACN和pECBACl的混合质粒。酶切验证结果见图15。
(2) 从转化至￡.co// DH10B的平板上随机挑取8个菌落提取质粒验证，发现8个都是正确 的单倍体。质粒电泳结果见图14。用Ncol及Sphl酶切验证，证明这8个质粒全部是纯 的pBACN，没有pECBACl混在其中。酶切验证结果见图15。SEQUENCE LISTING
<110>南京师范大学
<120> —种用于重组工程的大肠杆菌菌株
<130>
<160> 20
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gggctcgagg cggcgttgtg acaatttacc g 31
<210> 2
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
gggg吗ctcg aattgacata agcctg 26
<210> 3
<211> 37
<212> DNA <213>人工序列
<400> 3
ggggagctcc atcgatttat tatgacaact tgacggc 37
<210> 4 <211> 31 <212> DNA<213>人工序列
<400> 4
gggggatccg ctaatcttat ggataaaaat g 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
ggggaattcg cacgaactgg cacatttgct gg 32
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 6
gggctcgagg gaaaatgctg cgctcagtac
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 7
gggctcgaga tcataacccg tatgtgcaac
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 8
gggggtaccg gtgaatatgc agcggagatt c
<210> 9 <211> 21
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30
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atgtctgaat tagttgtttt c
<210> 10
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<212> DNA <213>人工序列
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caacgtatca gtcgggcggc c
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 11
gttcgatcga tttctggata g
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<400> 12 ggtcgatgtt tgatgttatg g
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cgacccacag gaactgatca c <210> 14
说明书第17/19页
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attcaaacag ggttctggcg tc
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tctcacatgg gccttgcggc ac
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atgaaattcg cctcaatccc g
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atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag tatggacagc 60 aagcgaaccg g 71
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ttgattggct ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc tcagaagaac 60tcgtcaagaa g 71
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taagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc tatggacagc 60 aagcgaaccg g 71
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 20
gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg tcagaagaac 60 tcgtcaagaa g 7权利要求
1、一种用于重组工程的大肠杆菌工程菌，其特征在于，是将来源于大肠杆菌的阿拉伯糖操纵元的调节基因araC，阿拉伯糖操纵元的启动子pBAD，来源于λ噬菌体的重组酶基因redα、red β和gam，来源于大肠杆菌recA基因和庆大霉素抗性基因Gm，一起整合至大肠杆菌DH10B的基因组中的endA基因区域而获得；其中redα，redβ，gam和recA由pBAD启动子所驱动。
2、 如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，是大肠埃希氏菌(Esc;^ c/^/flco//)CGMCC No. 3192或其变异体。
3、 如权利要求2所说的大肠杆菌工程菌，其特征在于，该菌株含有来源于X噬菌体的重组 酶基因reda, red(3和gam和来源于大肠杆菌recA基因。
4、 如权利要求1或3所说的大肠杆菌工程菌，其特征在于，reda, re邻和gam和recA基 因受受由L-阿拉伯糖诱导的pBAD所驱动。
5、 如权利要求4^f说的大肠杆菌工程菌，其特征在于，pBAD启动子受araC基因所调节， araC基因在L-阿拉伯糖存在时才发挥调节功能。
6、 如权利要求5所说的方法，其特征在于，重组酶可催化DNA短片段之间的同源重组， 即重组工程。
7、 如权利要求1所说的大肠杆菌工程菌，其特征在于，araC， pBAD， reda， re邻，gam和 recA基因，整合至大肠杆菌DH10B基因组中的endA基因区域，endA基因被去除。
8、 如权利要求l所说的大肠杆菌工程菌,其特征在于，庆大霉素抗性基因Gm和araC，pBAD， reda， re邻，gam和recA基因连接在一起，作为基因整合菌株的筛选标记。
全文摘要
本发明涉及一株用于重组工程的大肠杆菌CGMCC No.3192及其变异体。该菌株是将行使重组工程的基因片段，即来源于大肠杆菌的阿拉伯糖操纵元的调节基因araC，阿拉伯糖操纵元的启动子pBAD，来源于λ噬菌体的重组酶基因redα，redβ和gam，来源于大肠杆菌recA基因和庆大霉素抗性基因(Gm)一起，整合至大肠杆菌DH10B基因组中的endA基因区域而获得。其中redα，redβ，gam和recA受由L-阿拉伯糖诱导的pBAD所驱动。重组酶可催化DNA短片段之间的同源重组，即重组工程。DNA片段长度约为50个碱基对。以本菌株进行重组工程的操作简便，重组效率高，可成为通用的重组工程用菌株。
文档编号C12N1/21GK101633901SQ200910184219
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者杰 宋, 尚广东, 黄慧颖 申请人:南京师范大学