专利名称：高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌菌株及其γ-氨基丁酸生产方法
技术领域：
本发明涉及一种高产Y-氨基丁酸大肠杆菌ZS-07菌株及其γ-氨基丁酸的微生 物、酶法制备方法，属于生物化学领域。
背景技术：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是广泛存在于自然界的非蛋 白质氨基酸，是中枢神经系统重要的抑制性神经递质。大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、 帕金森等疾病。同时，GABA还与脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪，目不明”。因 此，GABA不仅具有安神和抗抑郁作用，而且还能增强脑功能和长期记忆。近年，随着人们对 GABA生理活性研究的不断深入，发现其生理功能极其广泛。例如可增加生长激素分泌，防止 肥胖，健肝利肾，改善更年期综合征，抑制大肠癌变，改善脂质代谢，促进精子的穿卵能力， 提高受精率，以及提高饲料利用率和日增重等。虽然GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较 强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力的加大等诸多因素使GABA 的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效改善这种状况，从而促进人体健康。GABA在临 床上常用于降低人体的血氨，治疗各种类型的肝昏迷，同时又被广泛地用于治疗各种脑疾 病，还可以作为儿童智力的营养补充剂和促进剂，老年人的营养剂。GABA正被广泛应用于医 药、食品保健、化工及农业等行业。GABA天然存在量很低，因此很难从天然组织中大量提取分离。目前，Y-氨基丁 酸的生产方法有化学合成法、植物富集法和生物合成法。化学合成法受到苛刻的反应条件 及昂贵的天然原料的限制，成本高、安全性差。植物富集法含量低，尚无法用作医药、医药中 间体和食品添加剂。与化学合成法相比，生物法合成GABA的主要优点是条件温和、不需要 昂贵的原料，能耗低。其原理是利用生物体的谷氨酸脱羧酶作为催化剂，以L-谷氨酸为底 物，将L-谷氨酸α-脱羧，产生Y-氨基丁酸和C02。由于微生物具有生长速度快、条件简 单、代谢过程特殊等特点，因此利用微生物生产GABA不受资源、环境和空间的限制，具有显 著的优势。筛选出具有高谷氨酸脱羧酶活力的优良菌株是利用微生物合成GABA的关键之
ο目前，在已有的利用不同种属微生物生产GABA的报道中，利用大肠杆菌的效率相 对较高。吴晓燕等(化工进展，2005,8 889-892)利用大肠杆菌Asl. 505，以DL-谷氨酸为 底物，15h内完全转化50g/LDL-谷氨酸形成D-谷氨酸和GABA。李永丰等(华东化工学院 学报，1981，2:7-11)用海藻酸钠-戊二醛法固定产谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌Asl. 505，在 pH4. 0的0. 2M醋酸缓冲液中，5h转化5%的谷氨酸合成GABA。赵景联等(生物工程学报， 1989,2:124-128)用海藻酸钙包埋法制成固定化大肠杆菌细胞，与1 %谷氨酸溶液进行间 歇反应，5h转化率达100%。张汝平等(长沙电力学院学报自然科学版，1998,4:433-435) 用海藻酸钙包埋法制备的大肠杆菌固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行 转化生产GABA，获得的GABA纯度达98. 94%，收率为49. 65%。Wang和Su利用Monascuspurpureus进行固体发酵，GABA含量分别达5004mg/kg和1200mg/kg。利用乳酸菌富集或 发酵生产GABA的报道也有很多，徐冬云等(现代食品科技，2006，3 :59-61，64)筛选出产 Y-氨基丁酸的乳酸菌，发酵样品中GABA的含量达0.463g/L。Nomura等(J Dairy Sci., 1998,81:1486-1491)从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus Iactis 01-7，生产的 奶酷中 GABA 含量达至Ij了 383mg/kg。Yokoyama 等(J of Bioscience and Bioengineering, 2002,1:95-97)利用 Lactobacillus brevis IF0-12005 对酒糟进行发酵，GABA 含量达到 了 10. 18mM。许建军等(博士学位论文，江南大学，2004年2月)筛选到了高产GABA的 Lactococcus Iactis菌株，25L罐发酵72h，GABA达到了 2. 5g/L。刘清等(氨基酸和生 物资源，2004，1 :40-43)也进行了高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件优化，发酵液中GABA 达 3. lg/L。爱宕世高等(食品科学，2001，8，81-85)采用 Lactobacillus ρIantarum 利 用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，干粉中含量达到了 5%。Takahashi等(J of Bioscience andBioengineering, 2004,6 :412_418)蹄选至Ij Sacharomyces cerevisiae UT-I的GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中 GABA浓度分别达到了 0.4mM和0.42mM，较野生株分别提高了 2.0和2.1倍。崔晓俊等(食 品工艺，2005，6 64-69)利用乳酸菌SK005在含9. 5g/L谷氨酸单钠的培养基中于30°C发酵 2天，GABA产量达5.4g/L。陆兆新等(CN 1710088A)公开了利用唾液链球菌嗜热亚种生产 GABA。梅乐和等(CN 1683545A，CN 1683544A, CN1673351A)公开了控制 pH 发酵生产 γ-氨 基丁酸的方法，其利用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)控制pH发酵40_60h，GABA的产量 为30g/L。江波等(CN 1392262)公开了一种食品功能因子Y _氨基丁酸的制备方法，GABA 在发酵液中的浓度达3-5g/L。焦庆才等(CN200410064813. 3)公开了一种Y-氨基丁酸的 酶法转化制备方法，将Escherichia coli ASl. 505的菌体细胞与含有L-谷氨酸和L-天冬 氨酸混合物的转化液混合，28-45°C下进行酶促反应，然后用等电点结晶或等电点结晶与离 子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的Y-氨基丁酸和L-天冬氨酸。蒋冬 花等(微生物学杂志，2007，1 :35-39)从酸菜中筛选到2株高产Y -氨基丁酸的乳酸菌，经 条件优化后发酵液中GABA含量可达4g/L。已有的关于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的研究主要是针对酶的结构、功能及表达调控 等方面。已公开的利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶制备GABA的专利和非专利文献结果，存在 酶活力不高，反应周期长，反应液中产物浓度低等问题。因此，筛选高酶活菌株实现Y-氨 基丁酸的工业化生产是目前市场所急需。
发明内容
本发明目的在于提供一种高产Y-氨基丁酸的大肠杆菌ZS-07菌株及其生产 Y-氨基丁酸的方法。本发明通过筛选得到一菌株，该菌株经形态特征、生理生化特征、生态特征比对及 16SrDNA序列测序，鉴定为大肠杆菌(拉丁文名称Escherichia coli)菌株。序列表中序列 1为大肠杆菌(拉丁文名称E. coli)ZS-07菌株16SrDNA序列；序列2为大肠杆菌菌株(拉 丁文名称E. coli)ZS-07gadA ；序列3为大肠杆菌菌株(拉丁文名称E. coli) ZS-07gadB序 列。本发明通过如下原理实现发明目的将本发明筛选得到的大肠杆菌ZS-07菌株或其谷氨酸脱羧酶作用于L-谷氨酸或L-谷氨酸盐以及含L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的物质， 使L-谷氨酸或L-谷氨酸盐发生脱羧反应生成Y-氨基丁酸。利用该菌株采用微生物法或 酶法生产Y-氨基丁酸，通过如下多种形式进行1、接种CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株的斜面培养物于种子培养基中， 35-39°C震荡培养6-9h制备种子液；在发酵培养基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 种相当于发酵培养基重量3-12%的种子液；35-41°C通气培养8-14h，于结束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431继续震荡培养0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的发酵液。2、接种CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株的斜面培养物于种子培养基中， 35-39°C震荡培养6-9h制备种子液；在发酵培养基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接种 相当于发酵培养基重量3-12%的种子液；35-41°C通气培养8-14h，于结束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌体，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐的转 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C震荡转化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的转化液。3、利用CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株培养制得的菌体或由其提取的谷氨 酸脱羧酶通过固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐的转 化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反应0. l_120h，得到含 Y-氨基丁酸的转化液。反应的底物可以是纯品DL-谷氨酸、纯品L-谷氨酸、纯品L-谷氨酸盐或纯品DL 谷氨酸盐，也可以是谷氨酸生产过程中各环节产生的含有DL谷氨酸或L-谷氨酸的粗品或 结晶母液；加入量为0. 5-450g/L ；加入方法可为一次性添加或分批次添加。上述方法还可以采用减压操作，加速反应进行，得到含Y-氨基丁酸的转化液。培养CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株所用的斜面培养基、种子培养基和发酵 培养基碳源可以采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、海藻糖、甘油、各类淀粉水解糖或其 混和物，其浓度为l_30g/L。氮源可以采用酵母膏、酵母粉、酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、牛 肉膏、豆饼粉、尿素或其混合物，浓度为l_30g/L。本发明的优势在于利用高渗条件筛选获得了一株谷氨酸脱羧酶活力高的大肠杆 菌E. coli ZS-07菌株CGMCC No. 3562，酶合成无需诱导，酶活力高(见附图1、表1)，菌株 耐酸能力强(见附图2、表2)，耐高浓度的底物和产物。利用其可生产高含量的Y-氨基丁 酸，反应体系简单，提取工艺可大为简化，生产成本大幅降低。经上述方法得到的转化液中 谷氨酸转化率达到100%，GABA浓度最高可达到315g/L。本发明研究人员给昆明小鼠灌喂 CGMCC No. 3562菌株的培养物(0. 2 X IO11Cfu/只)，未发现小鼠有任何不良反应。因此，利 用该菌株生产Y-氨基丁酸无安全隐患。另外，利用CGMCC No. 3562培养制得的菌体或谷 氨酸脱羧酶催化DL-谷氨酸中的L-氨基酸形成Y-氨基丁酸，经进一步分离Y-氨基丁酸 和D-谷氨酸，可同时获得了光学纯度大于98%的D-谷氨酸。本发明筛选得到的大肠杆菌(拉丁文名称E. coli) ZS-07菌株，已于2009年12月 31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号 院3号)，保藏编号为CGMCC No. 3562。
图1不同E. coli菌株合成GABA能力比较；实验条件LB培养基，L-谷氨酸添加 量为 30g/L ；菌浓 4. 6X10lclcfu/mL，41°C ；图中一为 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562，一为 DH5 α 菌株，一为BL-21菌株。图2不同Ε. coli菌株最适ρΗ比较；实验条件2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液反应 体系，菌浓 1. SxiO11CfuAiLdlt:振荡反应 30min ；其中图 a 为 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562 转化率随PH变化曲线(L-Glu添加量为30g/L)；图b为DH5 α菌株转化率随ρΗ变化曲线 (L-谷氨酸添加量为12g/L)；图c为BL-21菌株转化率随ρΗ变化曲线(L-谷氨酸添加量为 12g/L)。
具体实施例方式为对本发明进行更好地说明，举实施例如下实施例1CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基， PH7.0-7.8，于37°C震荡培养6-9h后，以3-12%的接种量接种至发酵培养基，ρΗ 7.0-7.8， 370C，220r/min,震荡培养8_14h后，于结束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，获得含菌体的发 酵液，4000r/min离心分离收集菌体。以相当于原发酵液体积的1/2倍的水重悬菌体，每 IOOmL菌悬液先加入L-谷氨酸15g，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，用盐酸或硫酸控制ρΗ为 3. 5-3. 8，41°C震荡反应，当无不溶底物存在时，补加底物L-谷氨酸15g/100mL。约反应20h 时，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，再补加底物L-谷氨酸15g/100mL，补加菌体(由相当于转 化液体积1/2倍量的发酵液制备)，继续反应，至底物转化完全。离心即得到含Y-氨基丁 酸的反应液，转化率达100%。斜面培养基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉 15g，水IL ；种子培养基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖lg，水IL ；发酵培养 基酵母提取物 3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g，葡萄糖 5g，Na2CO3O. 742g，NaHC037. 812g，水 IL0实施例2CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基，于 37°C震荡培养6-9h后，以3-12%的接种量接种至含有磷酸吡哆醛(0. 02mmol/L)的发酵 培养基中，PH7. 0-7. 8，37 °C震荡培养8_14h，于培养结束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，每 IOOmL发酵液加入28g L-谷氨酸，用盐酸或硫酸控制ρΗ为3. 5-3. 8，继续震荡或搅拌至底 物完全转化，离心即得到含Y-氨基丁酸的反应液，转化率可达100%。实施例3CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基， PH7. 0-7. 8，于37°C震荡培养6_9h后，以3_12%的接种量接种至发酵培养基，pH7. 0-7. 8， 37°C，220r/min,震荡培养8_14h后，于培养结束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，获得含菌体 的发酵液，4000r/min离心分离收集菌体。以相当于原发酵液体积的1/2倍的ρΗ为3. 5的 醋酸_醋酸钠缓冲液重悬菌体，每IOOmL菌悬液加入L-谷氨酸钠5g，用盐酸或硫酸控制ρΗ 为3. 5-3. 8，41°C震荡反应至底物完全转化，离心即得到含Y-氨基丁酸的反应液，转化率 达100%。GABA纯度达到国家规定医药级标准。实施例4
CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基， PH7.0-7.8，于37°C震荡培养6-9h后，以3-12%的接种量接种至发酵培养基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震荡培养8_14h，于结束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，获得含菌体的发酵 液，4000r/min离心分离收集菌体。加磷酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌悬液中加入 DL-谷氨酸30g (分2次加入，每次150g/L)，用盐酸或硫酸控制pH为3. 5-3. 8，41°C震荡至 反应完全，离心即得到含Y -氨基丁酸和D-谷氨酸的反应液，调整pH为3. 2，温度4-6°C， 搅拌，使D-谷氨酸结晶析出，用pH 3. 2的水洗涤结晶。含有少量D-谷氨酸和Y-氨基丁 酸的结晶母液进一步通过离子交换树脂分离。获得Y-氨基丁酸的同时获得了 D-谷氨酸。实施例5CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基， PH7.07.8，于37°C震荡培养6-9h后，以3-12%的接种量接种至发酵培养基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震荡培养8_14h后，于结束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，获得含菌体的发 酵液，4000r/min离心分离收集菌体。以相当于原发酵液体积的1/2倍的水重悬菌体，加磷 酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌悬液加入L-谷氨酸粗品25g，用盐酸/硫酸控制pH为 3. 5-3. 8，40°C震荡，抽真空减压反应至底物完全转化，离心即得到含、-氨基丁酸的反应 液，转化率达100%。实施例6CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株经斜面培养基活化后，转接于种子培养基， PH7.0-7.8，于37°C震荡培养6-9h后，以3-12%的接种量接种至发酵培养基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震荡培养8_14h后，于结束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，获得含菌体的发 酵液，4000r/min离心分离收集菌体。用pH 4. 0的醋酸缓冲液重悬，加入2%的海藻酸钠， 混勻，4°C静止Ih后用注射器针头滴加0. IM的CaCl2于溶液中，制备固定化细胞，每升反应 液添加磷酸吡哆醛0. 05mmol, L-谷氨酸或L-谷氨酸钠100g，控制pH 3. 8和温度39°C，反 应至底物完全转化，可得含Y-氨基丁酸的反应液，转化率最高达100%。E. coli ZS-07菌株利用细胞转化法合成GABA与有关文献结果比较见表1表 权利要求
一种高产γ 氨基丁酸的大肠杆菌ZS 07菌株，其特征为该菌株(拉丁文名称Escherichia coli)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3562。
2.如权利要求1所述的高产Y-氨基丁酸的大肠杆菌ZS-07菌株，其特征为该菌株 具有如序列1所示的16SrDNA序列。
3.如权利要求1所述的高产Y-氨基丁酸的大肠杆菌ZS-07菌株，其特征为该菌株 具有如序列2、3所示的gadA、gadB序列。
4.一种利用CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株生产Y -氨基丁酸的方法，其特征为 通过如下步骤实现接种CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株的斜面培养物于种子培养基 中，35-39°C震荡培养6-9h制备种子液；在发酵培养基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 种相当于发酵培养基重量3-12%的种子液；35-41°C通气培养8-14h，于结束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431继续震荡培养0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的发酵液。
5.一种利用CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株生产Y -氨基丁酸的方法，其特征为 通过如下步骤实现接种CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株的斜面培养物于种子培养基 中，35-39°C震荡培养6-9h制备种子液；在发酵培养基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 种相当于发酵培养基重量3-12%的种子液；35-41°C通气培养8-14h，于结束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌体，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐的转 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35-43°C震荡转化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的转化液。
6.一种利用CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株生产Y -氨基丁酸的方法，其特征为 通过如下步骤实现利用CGMCC No. 3562大肠杆菌ZS-07菌株培养制得的菌体或由其提取 的谷氨酸脱羧酶通过固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸盐 的转化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反应0. l_120h，得 到含Y-氨基丁酸的转化液。
7.如权利要求4-6任何一种利用CGMCCNo. 562大肠杆菌ZS-07菌株生产Y -氨基丁 酸的方法，其特征为采用减压操作，得到含Y-氨基丁酸的转化液。
8.如权利要求4-6任何一种利用CGMCCNo. 3562大肠杆菌ZS-07菌株生产Y -氨基丁 酸的方法，其特征为反应的底物是纯品L-谷氨酸、纯品L-谷氨酸盐或纯品DL-谷氨酸、纯 品DL谷氨酸盐，或是谷氨酸生产过程中各环节产生的含有L-谷氨酸或DL谷氨酸的粗品或 结晶母液；加入量为0. 5-450g/L ；加入方法可一次性加入或分批次添加。
全文摘要
本发明公开了一株安全、高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌(Escherichia coli) ZS-07菌株以及利用其合成γ-氨基丁酸的方法，属生物化学领域。该大肠杆菌菌株保藏编号为CGMCC No.3562，利用其含有的谷氨酸脱羧酶，作用于L-谷氨酸、L-谷氨酸盐或含L-谷氨酸或L谷氨酸盐的物质，合成γ-氨基丁酸。本发明菌株谷氨酸脱羧酶活力高、耐酸性强，反应条件温和，副产物少，方法简单，易于操作，成本低，生产效率高。产品纯度高，可用于化工、食品、饲料及医药等行业。
文档编号C12P13/00GK101974455SQ20101029471
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者吴健, 周新钦, 戴桂馥, 李季伦, 王卫富, 王廷, 王春阳, 蒋盛耀, 谭印成, 马文艳 申请人:郑州大学