专利名称：一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于棉花遗传育种技术领域，涉及用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种 的分子标记，具体涉及陆地棉抗黄萎病性状的分子标记定位、分子标记辅助选择效果评价 及育种应用。
背景技术：
利用分子标记技术，筛选不受环境因子影响，并与我国现有的抗黄萎病种质的抗 性基因紧密连锁的分子标记，就可应用于辅助选择抗病育种，从而加速抗黄萎病育种的进程。筛选与数量性状基因相连锁的分子标记的常用方法是进行QTL定位。QTL定位通 过分子标记进行遗传连锁分析，检测数量性状基因座并估算其效应大小。由于陆地棉种内 的遗传基础比较狭窄，国内外在进行棉花抗黄萎病性状的QTL定位时，常用陆地棉和海岛 棉的种间杂交来构建分离群体(高玉千等，棉花抗黄萎病基因的QTL定位，棉花学报，2003， 15(2) 73 78 ；杜威世等，棉花黄萎病抗性基因SSR标记研究，西北农林科技大学学报， 2004,32(3) :20 24 ;Bolek 等，Mapping of verticillium wilt resistance genes in cotton, Plant Science, 2005,168 :1581 1590 ；甄瑞等，海岛棉抗黄萎病基因SSR标记研 究，棉花学报，2006，18 (5) :269 272 ；昝伟等，海岛棉抗黄萎病性状分子标记的研究及QTL 的定位，新疆农业科学，2008，45 (5) :805 808)，这样得到的抗病QTL常常来自海岛棉亲 本，获得的分子标记只适用于海岛棉与陆地棉的杂交组合后代进行分子标记辅助选择(李 志坤等，棉花抗黄萎病基因的分子标记辅助选择研究。中国科技论文在线，http://www. paper, edu. cn)。而当前棉花生产及育种实践中大量使用的是陆地棉品种或陆地棉与陆地 棉品种之间配制的杂交组合，因此，如何发掘并有效利用陆地棉品种中与抗性基因相连锁 的分子标记，是实现分子标记辅助选择抗病育种的关键。对于陆地棉抗黄萎病基因的分子标记研究，目前仅限于找到了抗病标记，并没有 深入地对这些抗病相关的标记进行抗性方面的研究(蒋锋等，陆地棉抗黄萎病基因的分子 标记定位。中国科学C辑，2009，39 :849-861)，或者在验证分子标记的辅助选择效果时，仅 仅局限于双亲分离群体，而没有将其应用到整个大田育种群体(王芙蓉等，陆地棉品种抗 黄萎病性状的分子标记及其辅助选择效果。棉花学报，2007，19 =424-430) 0为了开发陆地棉抗黄萎病性状的分子标记，申请人构建了陆地棉种内的分子标记 遗传连锁图谱，利用单因子方差分析及复合区间作图对抗黄萎病性状进行QTL定位，选用 进入连锁群区段的显著性SSR标记及其与QTLs连锁的SSR标记对不同的陆地棉株系进行 筛选，最终得到了可用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的标记组合。
发明内容
本发明需要解决的问题是获得适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的 分子标记，包括其引物和引物组合，并将其用于陆地棉抗病材料的选育。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的SSR分子标记，按照下列步骤获 的1.构建抗黄萎病陆地棉品种‘常抗棉’和感黄萎病陆地棉标准系‘ΤΜ-Γ杂交的F2 分离群体，利用SSR、RAPD和SRAP三种分子标记构建陆地棉品种间分子标记遗传连锁图，同 时利用F2 3家系对抗黄萎病性状进行分子标记定位。结果如图1所示。2.选择单因子方差分析中表现显著性的SSR标记，和复合区间作图分析中与抗性 QTL紧密连锁的SSR标记。这些标记在连锁图谱上的分布在附图1中用下划线标出。3.选择不同的陆地棉株系，利用病圃对这些陆地棉株系进行抗黄萎病性鉴定，这 些株系的编号及系圃在附图2所示。4.从田间取步骤3)的陆地棉株系和常抗棉、TM-I植株的嫩绿叶片提取其总DNA。5.用步骤2)的SSR引物扩增步骤4)所示的材料(附图3)。6.分析图2所示的陆地棉株系标记基因型，获得陆地棉抗黄萎病性状的分子标 记，附图4。7.利用获得的抗黄萎病相关的SSR分子标记，对不同陆地棉株系进行分子标记辅 助选择，最后得到抗黄萎病的株系。本发明的有益效果是1.本发明将陆地棉株系按标记基因型分为“抗病标记基因型”和“感病标记基因 型”，在对株系进行分子标记辅助选择时，首先淘汰掉大部分“感病标记基因型”株系和“感 病”表现型株系，大大减小了选择的工作量；同时，要求当选株系在基因型上含有一个以上 的本发明获得的抗黄萎病相关的分子标记，在表现型上要求“抗病”或“耐病”，保证了表现 型和基因型的一致性，大大提高了选择的效率和准确性。2.综合利用本发明的3个标记(附图4种只标出了两个)对陆地棉株系进行筛 选，决选到的5个抗黄萎病株系在2008年、2009年的相对病指，最高的为19. 94，最低得为 15. 31，按抗病反应型分级标准全都达到了抗病水平。这说明利用本发明获得的分子标记还 可以筛选到抗病性表现稳定的陆地棉株系，提高抗病育种中选择的效率和选择的准确性。
图1 是本发明实施例1所构建的棉花分子标记遗传连锁图谱(常抗棉和TM-I的 F2代的遗传连锁图谱)及其QTL定位信息，其中带下画线的标记为本发明实施例1所选择 的SSR标记，含SSR标记39个，RAPD标记2个，SRAP标记7个，图距由Kosombi函数转化而 来，最大图距46. IcM图2 是本发明实施的棉花株系编号及其系谱来源。图3 是本发明的引物对棉花株系的扩增图(SSR引物在陆地棉后代选系中的基因 型)，M为Marker ；UMarker ；2、TM-I ；3、常抗棉；其它泳道为陆地棉后代选系。图4 是本发明获得的陆地棉抗黄萎病性状的分子标记序列。
具体实施例方式实施例11.取96个陆地棉株系(如图2所示)，分别以常抗棉、TM-I作为对照，将所述的材料种于黄萎病病圃，单行区，两次重复；2.于播种前接种中等致病力的安阳菌系黄萎病菌，于6月、7月、8月黄萎病发病高 峰期以感病对照病株率达80%或病指达50左右时，调查各供试材料的发病情况，采用5级 制进行棉花黄萎病分级(表1)，并计算病情指数和相对病情指数，最后按材料计算其平均 数作为平均病指。病情指数和相对病情指数的计算公式如下病情指数DI =(一级病株数X 1+ 二级病株数X 2+三级病株数X 3+四级病株 数X 4) + (调查总株数X 4)X 100相对病情指数RDI =校正系数KX鉴定材料病指校正系数K = 50/感病对照的实际病指，50为规定感病对照的标准病指表1
权利要求
1.一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，按照下列步 骤获得1)利用抗黄萎病陆地棉品种“常抗棉”和感黄萎病陆地棉标准系“TM-1”杂交的F2分 离群体，对抗黄萎病性状进行分子标记定位。2)依据SSR标记，对田间育种群体进行分组。3)分析每组的相对病指与标记基因型的有效性符合情况。4)标记基因型组间的相对病指差异显著或极显著的标记，被确定为陆地棉抗黄萎病辅 助选择育种的SSR分子标记。
2.根据权利要求1所述的对抗黄萎病性状进行标记定位，其特征在于用SSR、RAPD和 SRAP三种标记构建遗传连锁图，再用F2 3家系对抗黄萎病性状进行标记定位。
3.根据权利要求1所述的依据SSR标记，对田间育种群体进行分组，其特征在于依据 表现显著性的SSR标记和复合区间作图中与抗性QTL紧密连锁的SSR标记的基因型，对群 体进行+_标记记录分组。
4.根据权利要求1所述的分析每组的相对病指与标记基因型的有效性符合情况，其特 征在于计算每组的平均相对病指，每组的相对病指数值大小按无标记纯合基因型(一)、 杂合基因型(+_)、有标记纯合基因型(++)的排列顺序依次递减，则确定该标记在辅助选择 上具有有效性。
5.根据权利要求1所述的标记基因型组间的相对病指差异显著或极显著的标记，其特 征在于对初步确定的有效性标记，对其每组的平均相对病指数值进行差异显著性分析，达 到显著或极显著水平差异的标记。
6.根据权利要求1所述的被确定为陆地棉抗黄萎病辅助选择育种的SSR分子标记，其 特征在于SSR标记有三个，标记名称分别为BNL1721、BNL2733、BNL3452。
7.根据权利要求6所述的三个SSR标记，其特征在于每个SSR标记相应地需用三对 上、下游引物进行扩增。
8.根据权利要求7所述的SSR标记相应地上、下游引物，其特征在于标记 BNL1721 的上游引物(5 ‘ -3 ‘)为 TGTCGGAATCTTAAGACCGG、下游引物(5 ‘ -3 ‘)为 GCGCAGATCCTCTTACCAAA，标记 BNL2733 的上游引物(5' -3')为 TCGAGGGTTTAGGGTTCCTG、 下游引物(5‘ -3')为 AATTGTGCAACACCTCCCTC，标记 BNU452 的上游引物(5' -3')为 TGTAACTGAGCAGCCGTACG、下游引物(5' -3')为 GCCAAAGCAGAGTGAGATCC。
全文摘要
本发明涉及一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，属于棉花遗传育种技术领域。通过构建陆地棉种内的分子标记遗传连锁图谱，对抗黄萎病性状进行QTL定位，选用进入连锁群区段的显著性SSR标记及其与抗病QTLs连锁的SSR标记对不同的陆地棉株系进行筛选，最终得到了可用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的三个SSR标记。这三个标记包括其引物和引物组合，适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种。利用获得的分子标记，对不同陆地棉株系进行抗黄萎病分子标记辅助选择，最后得到抗黄萎病的株系。
文档编号C12Q1/68GK102080080SQ20101029445
公开日2011年6月1日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者李运海, 桑晓慧, 王红梅, 赵云雷, 陈伟, 龚海燕 申请人:中国农业科学院棉花研究所