专利名称：陆地棉中一个新的纤维发育相关microRNA基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及与陆地棉纤维发育相关的一个未知miRNA(ghr-MIR8)基因的克隆、鉴 定。对陆地棉徐州142胚珠分别建立了野生型(WT)和无绒无絮纤维突变体(M)两个小分子 RNA文库，采用了目前国际最先进的small RNA高通量测序列技术，获得了上述新的miRNA 基因序列。进一步预测该miRNA的靶基因，但未验证到靶基因。本发明属于生物技术领域。 ghr-MIR8在棉花纤维中被克隆到且在WT和M中表达丰度悬殊，可见该miRNA在纤维发育过 程中有着不容忽视的作用，因此研究该miRNA的功能对探究棉纤维发育的机理将会有推动 作用。
背景技术：
MicroRNAs(miRNAs)是一类主要在高等动植内新发现的内生的、非编码、长度为 20-25nt的单链小分子RNA。大量研究表明，miRNA作为真核生物基因表达的主要负调控因 子在调节植物生长发育，细胞增值、胁迫响应等过程中发挥着重要的作用。棉花是一种全球 性的重要经济作物，也是最主要的纺织纤维作物，在国民经济中占重要地位。我国是世界 上最大的棉花生产和消费国，也是一个重要的棉花贸易国，因此，棉花作为经济作物在我国 更是具有举足轻重的地位(http://WWW. emergingtextiles. com)。棉花纤维的发育机理迄 今还不清楚，因此成为备受关注的热点，因为它关系到如何提高棉纤维产量(提高单位面 积棉纤维伸长的数量)，改良纤维品质，而所有这些是与纺织工业和民生密切相关的现实问 题。随着现代分子生物学技术的发展，国内外除了利用常规育种手段外，逐步运用基 因工程技术对棉纤维品质进行遗传改良。利用基因工程改良纤维品质依赖于对纤维发育相 关基因及其调控元件的认识。因此，开展分离、鉴定与棉花纤维发育相关的功能基因是培育 优质棉纤维新品种，实现育种理论和关键技术新突破的重要基础，也是提升我国棉花育种 原始创新力的关键举措。据估计，棉花纤维发育过程中有上千特异基因表达，但到目前为止，仅有少数基因 被分离鉴定，对这些基因的表达机理及网络调控知之甚少。miRNA与棉纤维发育的关系更是 鲜有人研究。2007年我们实验室率先在已有的棉花基因组中挖掘出了 37miRNA。这也是国 内外迄今为止从棉花植物中发掘到最多的miRNA。这些重要的miRNA基因对调控棉花生长 及纤维发育具有重要的生物学意义及潜在的生产开发价值。因此，迫切需要对我国已有的 特色棉花资源，通过大规模克隆方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA(包 括其它sRNA)基因，为后期定向改良和培育优质性状的棉花种质奠定基础。本专利所克隆到的新的miRNA来自于陆地棉品种，在突变体及野生型中均表达， 其在突变体中相对于野生型表现为下调，但未预测到靶基因，可能与棉花至今还不完整的 基因组序列相关。ghr-MIR8在WT与M中的表达丰度差异表明其与棉纤维发育存在未知的 关系，因此，研究miRNA在棉花纤维发育中的作用具有重要的生物学意义和潜在应用价值。
发明内容
技术问题本发明的目的是克隆陆地棉纤维发育过程中一个重要的 miRNA (ghr-MIR8)，分析和鉴定了二级结构。对该miRNA基因的功能研究对棉纤维发育的机 理有一定的推动作用，且以此miRNA为基础，通过基因工程的方法研究棉纤维发育的机理 及改变目前棉纤维的品质特性，能够获得一定的经济及社会效益，为棉花的品质育种提供 基因资源，尽快提高我国棉花品种的纤维品质。技术方案陆地棉pre-ghr-MIR8 (基因表达前体)，长度为76bp，序列如下GGTGTGGGAGAGTTGGGCAAGAATTATGACCTTTGTTCAATCCAAAGGGGCAATTCTTACCAACCCCTC CCATACC1.按照 Illumina Sample Preparation Protocol 文库构建方法，分别构建了陆地 棉 Xuzhou-142 (WT)和 Xuzhou-142 光籽突变体(M)开花后(0，1，2，3，4，5，6，8，10 天，DPA) 胚珠cDNA两个文库。2.从文库中挑取克隆，进行转化，将分析得到的高质量的长度为18-30nt的小片 段RNA进行高通量测序。根据测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合miRNA标准 的序列。有益效果1.目前常用的sRNA克隆分析技术费时费力而且效率低、不灵敏，有些表达丰度低 或者特异性表达的小分子RNA根本测不出来。本研究采用目前国际上最先进的大规模高通 量测序，其优点为(1)灵敏度高，准确性高，能够测出一个拷贝的小分子RNA，测定的RNA分子的碱基 准确率高；(2)高通量、规模大，能够测定几乎所有基因组的转录子。两个文库的测序量高达 到130万条碱基序列以上，包涵所有的小分子RNA序列；(3)同时测定小分子RNA的表达丰度，因此可以比较两个基因文库中小分子RNA表 达谱的差异。2.本发明所克隆到的miRNA ghr_MIR8为棉花中未被发表过的非保守miRNA， miRNA与纤维发育的关系迄今研究甚少，该基因在纤维中被克隆到并在野生型及突变体中 表达量不同，以此基因作为目的基因，对棉花进行基因转化理论上可直接改变纤维质量或 数量等，并为探知纤维发育的机理再添一笔，而且可能有效地提高其种植生长效益，打破产 量品质的负相关，为棉花的品质育种提供基因资源，获得优质棉花，带来可观的经济社会效
frff. o3.目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要 求严格。本专利报道的基因来源于棉花，再导入棉花不存在安全性评价问题。同时，与棉纤 维发育相关的miRNA基因目前在国内外申请的专利甚少。
四
图1. ghr-MIR8前体二级结构图。该miRNA从无绒无絮纤维突变体及野生型陆地 棉中克隆得到，并具有较高的相对表达丰度。在5'及3'端均能检测到不同丰度片段(红字黑线部分)，3'端为miRNA*片段。五、发明的具体实施例1.棉花胚珠采集棉花种植地为江苏省农科院试验田，开花期进行挂牌。不同时 期胚珠采集后立即液氮冷冻，-80°C冰箱保存，备用。2.按照 Illumina Sample Preparation Protocol 文库构建方法，构建了 陆地棉 Xuzhou-142 (WT)和 Xuzhou_142 光籽突变体(M)开花后 0，1，2，3，4，5，6，8，10 天(DPA)胚珠 混合cDNA两个文库。3.从文库中挑取克隆，进行分离鉴定转化，将分析得到的高质量的长度为 18-30nt的RNA进行高通量测序。根据测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合 miRNA标准的序列。
权利要求
陆地棉(Gossypium hirsutum)中新发现的miRNA基因ghr-MIR8在突变体M及野生型WT中均克隆到，其成熟片断为19个碱基，5′到3′序列为GGTGTGGGAGAGTTGGGCA，前体基因为109888627。
2.根据权利要求1，该miRNA基因在陆地棉野生型及无绒无絮突变体中均表达，但在二 者中的表达丰度不同，其在突变体中成熟片段分别在5'端及3'端的表达丰度分别为24 和4，而在野生型中成熟片段分别在5'端及3'端的表达丰度分别为77和3，该miRNA在 突变体中的表达丰度相对于野生型来说下调，表明该miRNA基因对纤维发育起着一定的作用。
全文摘要
MicroRNAs(miRNAs)是一类主要在高等动植内新发现的内生的、非编码、长度为20-25nt的单链小分子RNA。它们主要在转录后水平上与其特定的靶基因mRNA互补结合，通过引起靶基因的降解或翻译抑制来调节基因的表达。本发明建立了棉花野生型(Xuzhou-142)及其无绒无絮纤维突变体(光籽，Xuzhou142 fuzzless-lintless)胚珠两个小分子RNA文库，采用了目前国际最先进的高通量测序技术(Solexa)，获得了一个未知的miRNA基因，暂时命名为ghr-MIR8，并研究其在棉花纤维初始发育过程中的不同表达丰度。通过基因工程手段与方法对该miRNA的研究将为深入研究调控棉纤维生长发育和改良纤维品质奠定基础。
文档编号C12N15/29GK101812463SQ201010120459
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者杨志敏, 王芹芹 申请人:南京农业大学