棉花植物事件aD14-2以及用于其检测的组合物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育 种领域，特别是涉及具有改良棉花纤维品质的棉花转化事件aD14-2,以及检测该转化事件 的特有方法。
【背景技术】
[0002] 棉花纤维是棉花生产的主要产品，棉花纤维的产量和品质直接决定了棉花生产的 产值和效益。因此，提高棉花纤维品质一直是棉花育种的主要目标。但是棉花的产量和品质 均为数量性状，受到多种因素的影响并且产量与品质之间存在负相关，严重阻碍着棉花纤 维品质和产量的同步改良。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二 倍体的瑟伯氏棉（纤维强度）、异常棉（纤维强度与细度）以及四倍体的海岛棉（纤维强度 与细度）等。这些优良性状基因的利用，在常规育种中却受到诸多限制，单靠现有的棉花遗 传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺 革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目 的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质 的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质（强度、 细度和长度等）直接相关的基因，使导利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。
[0003] 棉纤维的品质主要由棉花纤维细胞的分化与发育阶段决定，是一个复杂有序的过 程，在不同的发育时期均有大量的基因表达，参与纤维细胞发育的调控。棉纤维细胞由胚珠 外珠被单个细胞分化而来，是高等植物中伸长最快、合成纤维素最多的模式单细胞。其分化 和发育过程可分为纤维细胞分化与突起、纤维细胞的迅速伸长、次生壁的合成和脱水成熟4 个时期，是多种基因共同表达调控的复杂过程。其中纤维伸长和次生壁合成两个时期部分 重叠，对纤维的发育与品质形成关系密切。棉纤维的品质主要包括纤维长度、强度、伸长 率、麦克隆值等性状。纤维的起始与伸长直接影响到纤维的数量与长度，而次生壁加厚期纤 维素的合成则影响纤维的强度与麦克隆值等性状。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成 的分子机理也知之甚少。这些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。
[0004] 目前通过分子生物学手段改良棉花纤维品质的思路主要是通过植物转基因技术 导入能调控棉花体内激素、纤维素及多糖合成的基因。John等（1996)将乙酰CoA还原酶基 因（phaB)和PHB合酶基因（phaC)导入到陆地棉栽培种中，转基因棉纤维品质如强度、长度 等虽然没明显的改良，但转基因棉花的吸热性和导热性能明显增加。J〇hn(1999)将与生长 素合成相关的基因 iaaM和iaaH导入常规棉花中，虽然转基因棉纤维中IAA的含量显著地 增加然而纤维长度、细度和强度与对照相比没有显著差异。Jiang等（2011)将纤维素合酶 基因（GhSusAl)转入棉花中，结果表明过度表达GhSusAl基因的棉花株系纤维品质明显高 于非转基因株系。
【发明内容】
[0005] 本发明人通过转基因方法获得了转基因事件aD14_2的棉花品系。该转化事件 具有稳定的改良棉花纤维品质的性状。其代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 8881，分类命名为陆地棉，拉丁文名称是 Gossypium hirsutum，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏日期为2014年5月8日。
[0006] 本发明的第一方面提供棉花转化事件aD14_2,其特征序列如SEQ ID No :21所 示，其由第398-4145bp的T-DNA插入序列，第l-397bp上游侧翼棉花基因组序列和第 4146-4489bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。
[0007] 本发明的第二方面提供一种核酸构建体，其包含所述棉花转化事件aD14_2。
[0008] 本发明的第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第一方面所述的T-D ΝΑ插入 序列或含有棉花转化事件aD14_2的核酸构建体。在一个实施方案中，所述载体为说明书附 图 1 中的 p2300-pE203-mCBD 载体。
[0009] 本发明第四方面提供一种重组细胞，含有本发明第一方面所述的T-DNA插入序列 或本发明第二方面所述的核酸构建体或本发明第三方面所述的载体，所述重组细胞为重组 农杆菌细胞。
[0010] 本发明第五方面提供用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件的引物对，其 由特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第一引物和特异性识别本发明第 一方面所述的任一侧翼序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物选自SEQ ID N0 :22或23时，所述第二引物选自SEQ ID N0 :14或17。在另一些实施方案中，所述第 一引物选自SEQ ID N0 :24或25时，所述第二引物选自SEQ ID N0 :15或18。
[0011] 本发明第六方面提供一种鉴定棉花生物样品中aD14-2转化事件的方法，其包括：
[0012] (a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；
[0013] (b)以提取的DNA样品为模板使用本发明第五方面所述的引物对进行PCR扩增；
[0014] (c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID N0 :21上所述PCR引物对的 序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中aD14-2转化事件存在。
[0015] 本发明第七方面提供了一种制备转基因棉花的方法，培养含有本发明第一方面所 述的转化事件的棉花种子或其他组织，包括：利用含有本发明第一方面所述的转化事件材 料的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明第一方 面所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用本发明第六方面的方法在后代群 体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。
[0016] 本发明第八方面提供本发明第一方面所述的转化事件、发明第二方面所述的核酸 构建体、发明第三方面所述的重组载体、发明第四方面所述的重组细胞、发明第六方面或发 明第七方面所述的方法用于提高棉花纤维品质、进行植物育种以及用作分子标记的用途。
[0017] 本发明中利用的编码CBD蛋白的cbd基因 （GenBank :AAA23218. 1)来源于食纤维 梭菌（Clostridium cellulovorans)，该CBD蛋白是1990年由0· Shoseyov从食纤维梭菌中 纯化到的纤维素酶复合物的组成成分，该复合物对微晶纤维（crystalline celluose)有纤 维酶的活性。实验表明若将CBDs从纤维素酶或纤维小体的脚手架结构中去除将极大的降 低酶活。E.Shpigel对CBDs的功能研究发现，CBDs能在体外增强Prunus persica L.花粉 管的伸长；增加 A. Xylinum纤维素合成酶的活性，促进纤维素的合成。本发明利用纤维特 异性启动子EV0203驱动cbd基因，利用农杆菌介导的方法转化棉花，通过筛选获得棉纤维 衣份、比强和马克隆值均有明显改善的单拷贝转化事件aD14-2,并利用分子生物学手段获 得了该插入事件左右两侧的棉花基因组序列。
[0018] 本发明创造出的cbd基因的优质棉花转化事件，不仅可以显著改善棉花纤维品 质，遗传稳定、单拷贝整合且整合侧翼序列分子特征清楚，在生产育种中具有重要应用价 值，而且由于具有独特的检测方法，可方便地通过杂交聚合的方式聚合不同的商业化转化 事件。
【附图说明】
[0019] 图1示出了植物表达载体p2300-pE203-mCBD的构建流程。
[0020] 图2示出了利用Southern杂交技术对转基因事件aD14_2拷贝数进行检测的实验 结果。1，经Hind III酶切的含mCBD基因的质粒；2,经EcoR I酶切的转化事件aD14-2基 因组DNA件；3,经Hind III酶切的转化事件aD14-2基因组DNA ;Marker，经EcoR I/Hind III酶切的XDNA。
[0021] 图3是右边界（RB)旁侧序列示意图。
[0022] 图4是左边界（LB)旁侧序列示意图。
[0023] 图5是aD14_2事件的插入序列及鉴定引物的示意图。
[0024] 图 6 示出 了利用引物对 RBcheck51 ' /GSP2-mCBD32 '、RBcheck52 ' / GSP2-mCBD32，以及 LBcheck3r /GSP2-NPTII52，、LBcheck32，/GSP2-NPTII52，分别 扩增aD14_2事件和冀棉14的棉花样品结果。M，marker，ADNA/EcoR I+Hind III;1， 3 :RBcheck5r /GSP2-mCBD32 ^ 扩增 aD14-2 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 1810bp ;2， 4 :RBcheck52 ^ /GSP2-mCBD32 ^ 扩增 aD14-2 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 1665bp ;5， 7 iLBcheckSI' /GSP2-NPTII52'扩增 aD14-2 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 802bp ;6,8 : LBcheck32' /GSP2-NPTII52'扩增aD14-2事件和冀棉14,阳性扩增条带773bp。
【具体实施方式】
[0025] 在本发明中，"转化事件"是指外源插入DNA序列和特定棉花基因组DNA序列 的接合。"转化事件"并不是一种植物细胞或植株，植物细胞或植株是转化事件存在的载 体；转化事件的核心特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序 列和特定棉花基因组序列连接的一段特征DNA序列。
[0026] 具有某个转基因事件的植物品系被称为相同名称的品系。例如，具有aD14_2转基 因事件的植物品系被称为aD14_2品系。
[0027] 实施例
[0028] 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
[0029] 实施例1.植物表达载体构建
[0030] 因编码纤维素结合域CBD (cellulose binding domain)基因来源于食纤维梭菌， 其GC含量及密码子偏好性与棉花基因组有所差异，因此根据棉花密码子偏好改变其碱基 组成，用人工合成的方法合成SP和CBD基因融合序列（序列为SEQ ID N〇:l)，其中SP序 列来自拟南芥CEL1基因的N端24个碱基，为导肽序列。融合序列委托Takara公司进行全 基因人工合成新基因命名为SP+mCBD。选择植物双元表达载体pCAMBIA2300 (购自北京鼎国 昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强 子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选取来自棉花纤维中特异表达的启 动子EV0203(序列为SEQ ID No :2所示），驱动融合基因的表达，以Tnos作为终止子。
[0031] 用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4以