一种病毒核酸裂解液及其在利用硅胶膜吸附柱提取病毒核酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸裂解液及其应用，尤其涉及一种用于从全血、血浆或血清微 量样本中快速提取病毒核酸的裂解液及其在利用硅胶膜吸附柱提取病毒核酸中的应用。属 于核酸纯化领域。
【背景技术】
[0002] 核酸的提取纯化是进行分子生物学各项研究的基础，特别是在分子诊断领域， PCR、RT-PCR、Northern blot、RT-qPCR、cDNA文库构建、酶切等技术手段都需要纯度高、完整 性好的核酸。但由于外源及内源性核酸酶的存在及其酶活性相对稳定等原因，使得提取和 纯化高质量的核酸相对比较困难。核酸裂解液在核酸的提取纯化过程中对样本裂解和对最 终所得核酸的质量和得率有很大的影响，因此研发高效快速、回收范围广、得率高的核酸裂 解液是本领域不断探索的课题。
[0003] 目前市场上用于核酸提取的裂解液种类较多，常见的有经典的TRIzol、 CTAB-LiCl、碱裂解液等。TRIzol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞 内源性核酸酶，保持提取核酸的完整性；但是其实用时操作繁琐、费时，提取微量样本中核 酸的效果不佳。CTAB-LiCl在低离子强度的溶液中可与核酸形成不溶的复合物，有利于去除 多糖、酚类等杂质，常被用来提取植物样本材料的核酸，有局限性。碱裂解是最古老的核酸 的提取方法，但利用该法使用的碱裂解液裂解所得的核酸含有大量杂质，严重干扰下游实 验。经检索，针对从全血、血浆或血清等微量样本中快速提取病毒核酸的裂解液及其在利用 硅胶膜吸附柱法提取病毒核酸中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术，本发明的目的是提供一种用于从全血、血浆或血清微量样本中快 速提取病毒核酸的裂解液及其在利用硅胶膜吸附柱提取病毒核酸中的应用。
[0005] 本发明所述用于从全血、血浆或血清微量样本中快速提取病毒核酸的裂解液，其 特征在于：所述裂解液的组分及含量是：
[0006] 每升50mM ρΗ6· 0的Tris-HCl缓冲液中含有
[0007] 十二烷基硫酸锁 1.3 g/L TrilionX-100 6~39 mL/L 乙二胺四乙酸二钠 12.14 g/L 氯化锂 15.63 g/L 盐酸胍 480~561 g/L 柠檬酸钠 5 g L
[0008] 裾以((;丨 ycogen) 28.2mg./L 蛋白酶K 20 g/L 〇：
[0009] 上述用于从全血、血浆或血清微量样本中快速提取病毒核酸的裂解液，其优选的 组分及含量是：
[0010] 每升50mM ρΗ6· 0的Tris-HCl缓冲液中含有
[0011] 十二烷基硫酸钠 1.3 g/L TrillonX-100 30 mL/L 乙二胺四乙酸二钠 12.14 g/L 氯化锂 15.63 g/L 盐酸胍 480 g/L 柠檬酸钠 5 g/L 糖'h.:UGIycogeri) 28,2 mg/L 蛋白酶K 20 g/L B
[0012] 上述裂解液的配制方法是：
[0013] 分别称取十二烷基硫酸钠1.3g、乙二胺四乙酸二钠12. 14g、氯化锂15.63g、 盐酸胍480g、梓檬酸钠5g、糖原（Glycogen) 28. 2mg、蛋白酶K 20g，置于大烧杯中，加 入800mL 50mM pH6.0的Tris-HCl缓冲液后磁力加热搅拌至充分溶解，然后加入30ml TritionX-100,40°C水浴1小时，待彻底溶解后再滴加50mM pH6. 0的Tris-HCl缓冲液，定 容至体积总量为1L。
[0014] 本发明所述的裂解液在利用硅胶膜吸附柱提取全血、血浆或血清微量样本中病毒 核酸的应用。
[0015] 上述应用中，所述利用硅胶膜吸附柱提取全血、血浆或血清微量样本中病毒核酸 的方法是：
[0016] (1)取含病毒颗粒的全血、血清或血浆样本，相应加入等体积量的本发明所述的裂 解液，涡旋震荡，待彻底混匀后56°c水浴15min ;
[0017] (2)向上述裂解混合物中加入其1. 3~1. 4倍体积量的无水乙醇，震荡混匀，再室 温静置后转入硅胶膜吸附柱中8000r/min离心lmin，弃废液；
[0018] (3)向硅胶膜吸附柱中分别依次加入去蛋白液、漂洗液和无水乙醇，其间分别进行 8000r/min离心lmin，弃废液；
[0019] (4)把硅胶膜吸附柱转入一个新的收集管中，12000r/min离心3min，然后将吸附 柱置50°C开盖干燥2~5min，以彻底去除吸附材料中的无水乙醇；
[0020] (5)把干燥后的硅胶膜吸附柱放入另一洁净的离心管中，在吸附柱中央加入50~ 100 μ L无核酸酶的水，室温静置5~lOmin，12000r/min离心lmin，收集滤液，即得到病毒 核酸溶液。
[0021 ] 上述方法中所述的去蛋白液和漂洗液，是本领域的普通技术人员所熟知的常规试 剂。其中，去蛋白液各组分及其含量为：
[0022] 盐酸胍 477. 65 ~561. 25g/L
[0023] 无水乙醇 570 ~600mL/L
[0024] 上述去蛋白液的配制方法是：将所述各组分称量后，加20mM pH6. 0的Tris-HCl缓 冲液混合，使混合液体积总量为1L。
[0025] 漂洗液各组分及其含量为：
[0026] 氯化钠 2. 93 ~4. 85g/L
[0027] 无水乙醇 800mL/L
[0028] 上述漂洗液的配制方法是：将所述各组分称量后，加20mM pH6. 0的Tris-HCl缓冲 液混合，使混合液体积总量为1L。
[0029] 本发明提出一种性质温和且高效的适用于全血、血浆或血清等微量样本中快速提 取病毒核酸的裂解液及其在利用硅胶膜吸附柱法提取病毒核酸中的应用。为实现上述目 的，本发明人在查找阅读国内外病毒核酸提取文献的基础上，经过大量实验筛选和优化，确 立了一种用于从全血、血浆或血清微量样本中快速提取病毒核酸的裂解液配方，实现了从 体系中轻松捕获微量病毒核酸，具有方便快捷、产量高、重复性好的特点。经实验验证，使用 本发明的裂解液，利用硅胶膜吸附柱提取病毒核酸仅需30分钟，病毒核酸得率高、纯度好， 纯化的病毒核酸可用于荧光定量分析、体外翻译和分子克隆等等多种下游实验。本发明结 合裂解液特点还提供一种利用本发明的裂解液提取纯化血浆或血清等微量样本中病毒核 酸的方法。本发明与现有技术比，具有的突出优点和有益效果是：
[0030] a.独特的针对病毒核酸提取的裂解液，蛋白酶解和化学裂解同时进行，既避免了 酶解效率低的问题，也不会因常规的化学裂解反应剧烈导致核酸受到破坏；
[0031] b.裂解液中含有核酸共沉淀剂，在特定的pH下可以从样本中轻松捕获微量病毒 核酸，所得核酸回收率高；
[0032] c.操作流程简洁，30min内即可完成病毒核酸的提取纯化，比现有的大多数商品 化试剂盒都省时省力。
【附图说明】
[0033] 图1是本发明实施例2中所述的分别利用3名丙型肝炎患者抽取的血清提取HCV RNA的电泳检测。
[0034] 其中，泳道1、2、3为使用本发明的裂解液提取纯化的HCV核糖核酸。泳道Μ为脱 氧核糖核酸分子量标准（DL2000 Ladder)。
[0035] 图2是本发明实施例3中所述的分别利用5名乙型肝炎患者抽取的血清提取HBV DNA的电泳检测。
[0036] 其中，泳道1、2、3、4、5为使用本发明试剂提取纯化的HBV脱氧核糖核酸。泳道Μ 为脱氧核糖核酸分子量标准（DL2000 Ladder)。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1 :本发明所述核酸提取裂解液、去蛋白液和漂洗液的配制；
[0038] 裂解液的配制方法是：
[0039] 分别称取十二烷基硫酸钠1.3g、乙二胺四乙酸二钠12. 14g、氯化锂15. 63g、 盐酸胍480g、梓檬酸钠5g、糖原（Glycogen) 28. 2mg、蛋白酶K 20g，置于大烧杯中，加 入800mL 50mM pH6.0的Tris-HCl缓冲液后磁力加热搅拌至充分溶解，然后加入30ml TritionX-100,40°C水浴1小时，待彻底溶解后再滴加50mM pH6. 0的Tris-HCl缓冲液，定 容至体积总量为1L。
[0040] 去蛋白液的配制方法是：
[0041] 量取570mL无水乙醇，备用；称取盐酸胍480g，加入430mL 20mM pH6. 0的 Tris-HCl缓冲液，充分搅拌溶解，然后加入570mL无水乙醇，使混合液体积总量为1L ;
[0042] 漂洗液的配制方法是：
[0043] 量取800mL无水乙醇，备用；称取氯化钠3. 0g，加入200mL 20mM pH6. 0的 Tris-HCl缓冲液，充分搅拌溶解，然后加入800mL无水乙醇，使混合液体积总量为1L。
[0044] 实施例2 :从三例丙肝患者样本的血清中提取HCV RNA
[0045] 应用实施例1配