人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，具体而言，本发明涉及人乳头瘤病毒58型 杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体以及编码它们的序列，和它们进行诊断、预防和治疗 的应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒(HPV)是无包膜的双链小DNA病毒，主要侵及人的上皮组织，进而诱 发各种良、恶性增生病变。高危型HPV感染与多种恶性肿瘤的发生相关，低危型的HPV感染则 弓丨起肛门和生殖疣。HPV感染的流行范围广，所引发的相关致死性的恶性肿瘤和多种性传播 疾病对人类健康具有严重的危害性，开发安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。
[0003] HPV病毒颗粒直径为55~60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白L1的五 聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实，HPV L1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多种 表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似 的类病毒颗粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重组HPV L1-VLP疫苗已经成功上市并用于预防 HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病，并充分证明了 L1-VLP具有与野生同型病毒 相同的抗原性和免疫原性，其结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表 位，可诱导高滴度的中和抗体。
[0004] 国家食品药品监督管理局（croA)在《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》中指 出："在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进 行，保证产品的质量、工艺的稳定性"，同时要求"在半成品和成品阶段的质量控制至少包括 鉴别试验" 在HPV疫苗研发过程中，需要开展四个方面的测定，即型别鉴定实验、抗原含量检测和 体外效力测定。其方法均可以采用双抗体夹心法ELISA。因此，在疫苗研究中，单克隆抗体是 疫苗抗原质控的重要工具，尤其是具有特异性和中和活性的抗体在疫苗研发中具有不可替 代的作用。
[0005] 目前国外已上市的人乳头瘤病毒疫苗主要有三种，分别是：2006年首次上市的由 16、18、6和11型人乳头瘤病毒11重组蛋白构成的四价疫苗(6 &"&811)，2007年首次上市的 由16和18型乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的二价疫苗(Cervarix)，以及2014年12月首次上市 的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳头瘤病毒11重组蛋白构成的九价疫苗(6 &"&811 9)。本发明提供了最多可针对九价范围内HPV58的特异性和中和活性的单克隆抗体，利用其 中的两株制备的ELISA检测试剂盒，可以特异性地用于快速鉴别并定量HPV58 L1蛋白，可以 广泛应用于临床检测和目前疫苗厂家生产疫苗过程中的质检，对女性的健康发展和公共卫 生防控将具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供能够识别HPV58的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交 瘤细胞系。
[0007]本发明的第二个目的是提供一种用于检测HPV58的双抗体夹心ELISA试剂盒。
[0008]本发明的第三个目的在于提供单克隆抗体的制备方法。
[0009] 本发明的第四个目的在于提供HPV的抗原检测试剂盒的制备方法。
[0010] 本发明实验目的是通过如下技术方案实现： 本发明提供的单克隆抗体，其是以HPV58 L1五聚体蛋白作为免疫原，制备获得。具体地 说是HPV58 L1五聚体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到 能持续、稳定分泌抗HPV58 L1的杂交瘤细胞株，由各细胞株分泌得到单克隆抗体。
[0011] 在一个优选的实施方案中识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤 细胞株2F7产生，其保藏编号:CGMCC No. 11295;分类命名：杂交瘤细胞;保藏单位名称：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院 3号;保藏日期：2015年10月30日。
[0012] 本发明公开的单克隆抗体2F7,包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链 可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有⑶R序列⑶RL1、⑶RL2或/和⑶RL3，其中： CDRL1 包括SEQ ID N0:1; CDRL2包括SEQ ID N0:2; CDRL3包括SEQ ID N0:3。
[0013] 抗体重链可变区具有选自⑶RH1、⑶RH2或/和⑶RH3，其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:4; CDRH2包括SEQ ID N0:5; CDRH3包括SEQ ID N0:6。
[0014] 在一个优选的实施方案中人乳头瘤病毒58型LI蛋白的单克隆抗体或抗原结合片 段，包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQ ID N0:7和至少1个抗体重链可变区包括SEQ ID N0:8〇
[0015] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸，该核酸编码本发明抗体的 至少一个轻链可变区SEQ ID N0:7和重链可变区SEQ ID N0:8。
[0016] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体，该载体转染宿主细胞 时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
[0017] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种表达载体的宿主细胞。
[0018] 在一个优选的实施方案中本发明提供另一种人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆 抗体，其特征在于该单克隆抗体由杂交瘤细胞株2G7产生，其保藏编号:CGMCC No. 11296;分 类命名：杂交瘤细胞;保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保 藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2015年10月30日。
[0019] 由杂交瘤细胞株2G7产生的单克隆抗体，包含至少1个抗体重链可变区和至少1个 抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区具有⑶R序列⑶RL1XDRL2或/和⑶RL3,其 中： CDRL1 包括SEQ ID N0:9; CDRL2包括SEQ ID N0:10; CDRL3包括SEQ ID N0:11。
[0020] 由杂交瘤细胞株2G7产生的单克隆抗体的重链可变区具有选自⑶RH1、⑶RH2或/和 CDRH3,其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:12; CDRH2包括SEQ ID N0:13; CDRH3包括SEQ ID N0:14。
[0021] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种识别人乳头瘤病毒58型LI蛋白的单克 隆抗体或抗原结合片段，其特征在于其中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQ ID N0:15 和至少1个抗体重链可变区包括SEQ ID NO: 16。
[0022] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸，其编码本发明抗体的至少 一个轻链可变区SEQ ID N0:15和重链可变区SEQ ID N0:16。
[0023] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体，其载体转染宿主细胞 时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
[0024] 在一个优选的实施方案中本发明提供一种包括表达载体的宿主细胞。
[0025]另一方面本发明提供一种检测HPV58 L1的试剂盒，包括本发明公开的单克隆抗体 或抗原结合片段。
[0026]本发明公开的检测HPV58 L1的试剂盒，还包括可检测的标记:放射性同位素、焚光 物质、发光物质、有色物质和/或酶。
[0027]另一方面本发明提供一种检测一种特异性检测人乳头瘤病毒58型