一种与植物顶端优势相关的cad1蛋白及其相关生物材料与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种与植物顶端优势相关的CAD1蛋白 及其相关生物材料与应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长过程中，主茎顶端的生长点活动比较活跃，而侧芽的生长发育却受到 抑制，而当植物去顶后这种现象又会被解除，这种顶芽抑制侧芽生长发育的现象被称为顶 端优势（apical dominance)。几乎所有的高等植物在生长过程中都有顶端优势，它在植物 植株形态建成中起着至关重要的作用，是植物为了适应自然环境、繁衍存活的一种主动适 应方式。
[0003] 多年来诸多研究表明，植物顶端优势是受多个基因和多种激素共同调控的复杂的 生命现象。顶端优势不仅是植物必需的一种生存机制，其原理的利用在农业和园艺生产中 也有着重要意义，合理控制植物的顶端优势可用以有效改善株型和提高产量等。因此，通过 对水稻顶端优势的分子机理研究，克隆其调控网络中不同环节上控制植物顶端优势或分蘖 生长的关键基因，并通过基因工程等方法应用到实际生产中来，可以有效改良现有水稻品 种的株型，提高产量，从而缓解粮食供需矛盾，为解决当前人类所面临的粮食危机提供一个 新的突破口。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0005] 本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物顶端优势相关的蛋白质。
[0008] 本发明提供的所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
[0009] B1)编码上述所述蛋白质的核酸分子；
[0010] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0011] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0012] B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
[0013] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0014] 上述相关生物材料中，B1)所述核酸分子如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0015] 本发明的另一个目的是提供上述所述蛋白质或上述所述相关生物材料在增强植 物顶端优势中的应用。
[0016] 本发明还有一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。
[0017] 本发明提供的构建转基因植物的方法包括如下步骤：使上述所述蛋白质在出发植 物中过表达，转基因植物与出发植物相比，具有如下性状中的至少一种：
[0018] (1)植物的顶端优势增强；
[0019] ⑵株高增加；
[0020] (3)分蘖减少；
[0021] (4)茎杆变粗；
[0022] (5)株型变紧凑；
[0023] (6)穗粒数增加。
[0024] 上述方法中，所述使上述所述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物 中导入上述所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，顶端优 势增强。
[0025] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0026] 本发明最后一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。
[0027] 本发明提供的构建转基因植物的方法包括如下步骤：抑制上述所述蛋白质在出发 植物中表达，进而减弱植物的顶端优势。
[0028] 上述方法中，所述抑制上述所述蛋白质在出发植物中表达的方法为：向出发植物 中导入干扰载体PTCK303/JL1460-CAD1，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，顶 端优势减弱。
[0029] 上述方法中，所述干扰载体PTCK303/JL1460-CAD1的构建方法：用限制性内切酶 Spe I和Sac I对DNA片段A和骨架载体pTCK303/JL1460进行双酶切，将DNA片段A连 入PTCK303/JL1460载体，得到重组载体甲；用限制性内切酶BamH I和Kpn I对DNA片段 B和重组载体甲进行双酶切，将DNA片段B连入重组载体甲，得到所述干扰载体pTCK303/ JL1460-CAD1。
[0030] 上述方法中，所述DNA片段A的序列如序列表中序列1的第1025至1380位核苷 酸所示；DNA片段B的序列如序列表中序列1的第1011至1366位核苷酸所示。
[0031] 上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为 水稻。
[0032] 本发明通过实验证明，本发明提供的蛋白具有增强植物顶端优势，提高植物产量 的功能，在植物育种方面具有重要应用价值。
【附图说明】
[0033] 图1为YIL55与CAD1突变体的表型比较。
[0034] 图2为CAD1基因的精细定位与候选。
[0035] 图3为过表达转基因株系（p0E6)与空载对照（CL3)的表型比较。图3A过表达转 基因株系（P〇E6)与空载对照（CL3)的株型比较；图3B过表达转基因株系（p0E6)与空载对 照（CL3)的穗型比较；图3C基因在过表达转基因株系（p0E6)与空载对照（CL3)中的表达 量比较；图3D过表达转基因株系（p0E6)与空载对照（CL3)在株高、分蘖数、主茎直径、每穗 粒数和单株谷粒重的比较。
[0036] 图4为干扰转基因植株与空载对照的植株的表型比较。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 本发明引物合成及测序工作均由北京奥科鼎盛生物科技有限责任公司完成。
[0040] 实验材料：普通野生稻（0? rufipogon Griff.)的渗入系YIL55在文献"Tan LB, Liu FX, Xue ff, Wang GJ, Ye S,Zhu ZF, Fu YC, Wang XK, Sun CQ. Development of Oryza rufipogon and Oryza sativa introgression lines and assessment for yield-related quantitative trait loci. Journal Integrative Plant Biology, 2007, 49:871-884，'中公 开过，公众可以从中国农业大学获得。
[0041] pTCK303/JL1460 载体在文献 "Wang Z, Chen CG, Xu YY, Jiang RX, Han Y, Xu ZH and Chong K.A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular Biology Reporter, 2004, 22:409 - 417." 中公 开过，公众可以从中国农业大学获得。
[0042] pCAMBIA13(U-Ubiq 载体在文献"Yu BS, Lin ZW，Lin HX, Li XJ, Li JY, WangYH, Zhang WX, ZhuZF, Zhai WX, Wang XK, Xie DX, Sun CQ. TAC1, a major quantitative trait locus controlling tiller angle in rice.Plant J, 2007, 52:891-898. "中公开过，公众可以从中国农业大学获得。
[0043] 实施例1、控制水稻顶端优势CAD1基因的获得
[0044] 将普通野生稻渗入系YIL55经EMS处理并经过多代自交和性状观察后，形成基因 型纯和的突变体系。通过对这些突变体系的筛选发现了一个株高增加、分蘖减少、茎杆变 粗、株型变紧凑及穗粒数增加的突变体，同野生型植株相比其顶端优势明显增强，将此突变 体命名为CAD1 (如图1所示）。
[0045] 将CAD1与其诱变亲本HL55,进行杂交，杂交匕代表现为突变体表型，从而可以推 测出控制这个突变性状的基因是显性的。杂交Fi经过自交后产生匕后代中，表型和CAD1 相同的单株与和野生型相同的单株比例接近3:1 ( x 2 = 0. 015 ;P = 0. 726)。由此可以得出 CAD1突变体表型性状由一个显性单基因控制，这个基因被命名为CAD1。
[0046] 首先用CAD1与日本晴杂交的小F2群体，将基因CAD1初略定位在第8染色体的SSR 标记RM223与RM339之间。之后，用扩大的F 2群体将基因CAD1定位在两个新开发的标记 sp5和sp7之间。这两个标记间物理距离约51kb，根据预测结果该区段内共含有7个基因。 设计引物扩增CAD1和HL55基因组DNA，对该区段进行测序，寻找EMS诱变产生的基因序列 方面的差异（如图2所示）。测序结果显示在该定位区段内，在L0C_0s08g31470的第4外 显子、CDS的第1244碱基处，有1个核苷酸由G突变为A，从而导致所编码的氨基酸由谷氨 酰胺改变为精氨酸。
[0047] 为验证上述突变是否为控制水稻顶端优势基因 CAD1，对由CAD1突变体和日本晴 构建的F2中3个显性交换单株进行了基因型检测，测序结果发现所有的交换单株在突变位 点均发生了与突变体CAD1相同的碱基替换。
[0048] 为进一步验证上述碱基突变是否是真实突变，按照上述方法对200份水稻品种和 地方种及100份野生种分别提取其基因组DNA，并进行PCR扩增、测序，分析其在这些水稻样 品中的序列。
[0049] 测序结果表明：所有测试水稻样品在碱基变异处均与野生型YIL55序列一致，表 明该碱基突变只存在于CAD1突变体中，CAD1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，CAD1 蛋白的编码基因序列如SEQ ID No. 1所不。
[0050] 实施例2、CADI转基因水稻的获得及其鉴定
[0051] 一、CAD1植物过表达载体的构建
[0052] 根据CAD1突变体中的L0C_0s08g31470的全长cDNA序列设计引物，并在引物两端 分别引入限制性内切酶Kpn I和Sac I识别位点及保护碱基，引物序列如下：FL1 F:5'-IM GTACCATGCGG