一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取分离技术领域，具体涉及一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取 分离方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重威胁人类生命的的重大疾病。据统计，恶性肿瘤已成为城乡居民的首 要死因，而且呈现年轻化合逐年上升趋势，全国癌症的平均5年存活率仅为25 %左右，可见 肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤的主要治疗手段，虽然目前已经开发了数十 种抗肿瘤药物，有效延长了患者生命或者提高了患者生存质量，但是肿瘤的药物研究还是 面临着巨大挑战，抗癌药物多有细胞毒药物，副作用多；而中药有几千年的人体毒性实验的 基础，从天然产物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性化合物一直是研究热点。
[0003] 水线草，又名伞房花耳草，为茜草科一年生草本植物，耳草属植物水线草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草。苦、寒，入肺、大肠二经;具有清热解毒之功效，常用于烫伤，与 常山、马鞭草混合煎服能治疟疾。目前临床上，水线草的主要用途是与白花蛇舌草混用治疗 癌症(南京新医学院.中药大辞典.上海.上海科学技术出版社，1977: 535 .)，但其抗肿瘤物 质基础尚不明确。
[0004] 水线草中主含的化学成分为环烯醚萜及其苷类和三萜酸类化合物。鸡矢藤苷甲酯 (又称鸡屎藤苷甲酯)为环烯醚萜类化合物，是从水线草中分离得到的。早在1988年，就有研 究表明鸡矢藤苷甲酯及其相关衍生物具有抗肿瘤和抗氧化活性。（Ishig Ur〇，Ky〇k〇; Yamaki，Masae;Takagi，Shuzo;Ikeda，Yoshiaki;Kawakami，Kiyotaka;Ito，Keizo;Nose， TakashiStudies on iridoid-related compounds.V.Anti tumor activity of iridoid derivatives periodate oxidation products.Journal of Pharmacobio-Dynamics (1988)，ll(2)，131-6.)。
[0005] 目前尚未检索到水线草中鸡矢藤苷甲酯提取分离方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法。
[0007] 为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，包括以下步骤：
[0009] 1)将水线草用醇溶剂进行提取，得到水线草醇提物；
[0010] 2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取;取正丁醇萃取 部位，浓缩得精提浸膏；
[0011] 3)将所述精提浸膏用甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经正相硅胶柱层析，用 洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液;所述洗脱剂为氯仿-甲醇洗脱剂，和/或二氯甲烷-甲醇 洗脱剂；
[0012] 4)将步骤3)所述洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法进一步纯化，制得鸡 矢藤苷甲酯；
[0013] 所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，以氯仿-甲 醇作为洗脱剂;收集洗脱液后经0DS反相柱层析，以甲醇溶液等度洗脱或者梯度洗脱，收集 洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯；
[0014] 所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液进制备液相，以甲醇水为流动相进 行洗脱，制得鸡矢藤苷甲酯;所述制备液相采用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm) 制备柱。
[0015] 上述水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，其中：
[0016] 步骤1)中优选先将水线草粉碎再进行提取，优选为60-80目；所述提取温度优选为 60-80°C;所述醇溶剂为乙醇或甲醇溶剂，优选为甲醇溶剂;所述醇溶剂的浓度为50%_70% (质量浓度），优选70 % (质量浓度）；更优选为70 %的甲醇（质量浓度）；所述提取方法为回流 提取、超声提取、浸渍提取等方法中的一种或几种;优选为回流提取;所述醇溶剂的用量为 水仙草重量的8-15倍，优选为10倍。
[0017] 为尽量将水仙草中鸡矢藤甲酯提取出来，步骤1)优选包括将水线草粉碎至60-80 目，加入8-15倍重量的70 %甲醇（质量浓度），搅匀，先超声提取0.5-lh，然后回流提取l-3h， 提取温度为60_8(TC ;过滤;滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取;共提取三次，合 并滤液，减压浓缩得到水线草醇提物(即粗提浸膏）。
[0018] 步骤2)所述石油醚萃取优选为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次， 所述与石油醚的用量(重量)比例为1-3:4-6;萃取后保留水部位。
[0019]步骤2)所述乙酸乙酯萃取优选为将石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5 次，石油醚萃取后所述水部位与乙酸乙酯的用量（重量）比例为1-3:4-6;萃取后保留水部 位。
[0020] 步骤2)所述正丁醇萃取优选为将乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5 次，乙酸乙酯萃取后所述水部位与正丁醇的重量比例为1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部 位。
[0021] 取正丁醇萃取部位，浓缩(例如减压浓缩)得精提浸膏。
[0022]按上述方法萃取处理后，最大限度地去除了所述水线草醇提物中杂质。
[0023] 步骤3)优选将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，再进行过滤。
[0024] 步骤3)所述梯度洗脱包括以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别以氯仿：甲醇(体积比）为7: 1，5:1，3:1进行第一次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液;再以氯仿-甲醇为洗脱剂， 分别以氯仿：甲醇(体积比）为12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇 为7:1的洗脱液;或者以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，分别以二氯甲烷：甲醇(体积比）为12:1， 9:1，7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇为7:1的洗脱液。
[0025]本发明所述第二次梯度洗脱是指收集第一次洗脱液，硅胶拌样经正相硅胶柱层 析，进行第二次洗脱。
[0026]步骤3)优选采用100-200目的正相硅胶柱层析。
[0027]步骤4)所述葡聚糖凝胶柱层析，以氯仿：甲醇(体积比）60 :40为洗脱剂进行洗脱； 所述0DS反相柱层析，以30%甲醇溶液（质量浓度）进行等度洗脱或者以20-50%甲醇溶液 (质量浓度)进行梯度洗脱。
[0028] 所述0DS反相柱是指十八烷基硅烷反相柱。
[0029] 具体地，步骤4)所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层 析，用氯仿：甲醇体积比为60:40的洗脱剂进行洗脱；收集洗脱液后经DMS0反相柱层析，用 30%甲醇溶液等度洗脱或者20-50%甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯。
[0030] 步骤4)所述制备液相分离法先将步骤3)所得洗脱液经0.22M1微孔滤膜过滤，再取 滤液进制备液相。
[0031] 所述洗脱剂为25%甲醇水。
[0032] 所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm)制备柱。
[0033] 具体地，步骤4)所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液经0.22M1微孔滤膜 过滤，取滤液进制备液相，以25 %甲醇水为洗脱剂等度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲 酯;所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18，（250*21.2mm)制备柱。
[0034] 较佳地，本发明所述水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，包括以下步骤：
[0035] 1)将水线草粉碎至60-80目，加入8-15倍重量的70%甲醇，搅匀，先超声提取0.5- lh，然后回流提取l-3h，提取温度为60-80°C ;过滤;滤渣按上述方法再次进行超声提取、回 流提取;共提取三次，合并滤液，减压浓缩得到水线草醇提物；
[0036] 2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取;取正丁醇萃取 部位，浓缩得精提浸膏；
[0037]所述石油醚萃取为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草 醇提物与石油醚的用量(重量)比例为1-3:4-6;萃取后保留水部位；
[0038] 所述乙酸乙酯萃取为将石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚 萃取后所述水部位与乙酸乙酯的用量(重量)比例为1-3:4-6;萃取后保留水部位；
[0039]所述正丁醇萃取优选为将乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸 乙酯萃取后所述水部位与正丁醇的用量(重量）比例为1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部 位；
[0040] 3)将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经100- 200目正相硅胶柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液；
[0041 ]具体地，所述梯度洗脱以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别以氯仿：甲醇体积比为7 :1，5: 1，3:1进行第一次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液;再以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别 以氯仿：甲醇体积比为12:1，9:1，7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1 的洗脱液;或者以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，分别以二氯甲烷：甲醇体积比为12:1，9:1，7:1， 5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇为7:1的洗脱液；
[0042] 4)将所述第二次梯度洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法进行进一步纯 化，得到鸡矢藤苷甲酯；
[0043] 所述柱层析分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析， 用氯仿：甲醇体积比为60:40的洗脱剂进行洗脱;收集洗脱液后经0DS反相柱层析，用30 %甲 醇溶液等度洗脱或者20-50%甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯；
[0044] 所述制备液相分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液经0.22wii微孔滤膜过 滤，取滤液进制备液相，以25%甲醇水为洗脱剂等度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯； 所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm)制备柱。
[0045]本发明所述鸡矢藤苷甲酯结构如下式(I)所示：
⑴
[0047]本发明所述水线草，又名伞房花耳草，为茜草科一年生草本植物，耳草属植物水线 草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草。
[0048]本发明有益效果
[0049] 本发明方法分离水线草中鸡矢藤苷甲酯成分的产率高，方法简便快捷，纯度高;所 得鸡矢藤苷甲酯可用于制成抗肿瘤的辅助药物，为研发抗癌药物提供一定的应用价值。
【附图说明】
[0050] 图1为鸡矢藤苷甲酯紫外吸收图。
[0051] 图2为鸡矢藤苷甲酯质谱图。
【具体实施方式】
[0052]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0053] 实施例1
[0054]本实施例提供一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，包括以下步骤：
[0055] 1)称取粉碎至60目的水线草10kg，加入100L体积的70 %甲醇(质量浓度），搅匀，先 超声提取30min，然后80°C下