回流提取lh，过滤;滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提 取;共提取三次，合并滤液，减压浓缩得到水线草醇提物(粗提浸膏)2kg。
[0056] 2)将该水线草醇提物（粗提浸膏）分别依次用石油醚，、乙酸乙酯、正丁醇依次萃 取，收集正丁醇萃取部位，减压浓缩，得精提浸膏〇.674kg。所述石油醚萃取为将步骤1)所得 水线草醇提物用石油醚萃取3次，所述水线草醇提物与石油醚的重量比例为1:4;萃取后保 留水部位；
[0057] 所述乙酸乙酯萃取为将石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3次，石油醚萃 取后所述水部位与乙酸乙酯的用量(重量)比例为1:4;萃取后保留水部位；
[0058]所述正丁醇萃取为将乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3次，乙酸乙酯萃 取后所述水部位与正丁醇的用量(重量)比例为1:4;萃取后保留正丁醇萃取部位；
[0059] 3)将该精提浸膏用用3倍重量的甲醇超声溶解，过滤，去除滤渣，滤液硅胶拌样经 100-200目正相硅胶柱分别以氯仿：甲醇(体积比）7:1，5:1，3:1为洗脱剂进行第一次梯度洗 脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液;然后再分别以氯仿：甲醇(体积比）12 :1，9:1，7:1，5:1， 3:1为洗脱剂进行第二次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液。
[0060] 4)将步骤3)第二次梯度洗脱所得氯仿：甲醇为7:1的洗脱液采用葡聚糖凝胶 (86口1^(1611^-20)柱层析分离纯化，用氯仿：甲醇(体积比）为60:40为洗脱剂进行洗脱 ；收 集洗脱液后再经0DS反相柱(YMC GEL 50)用30%甲醇溶液(质量浓度)等度洗脱，收集洗脱 液，制得鸡矢藤苷甲酯2.6g。
[0061 ] 实施例2
[0062] 本实施例提供一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，与实施例1的区别在 于，步骤4)采用制备液相分离法，即将步骤3)第二次梯度洗脱所得氯仿：甲醇为7:1的洗脱 液经0.22wii微孔滤膜过滤，取滤液进制备液相，以25 %甲醇水为洗脱剂等度洗脱，使用LC-3000高效液相Thermo C18( 250*21.2mm)制备柱。以标准品出峰时间比较接样，最终得到化 合物鸡矢藤苷甲酯2. lg。
[0063] 实施例3
[0064] 本实施例提供一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，与实施例1的区别在 于，步骤4)所述0DS反相柱层析，用20-50%甲醇溶液(质量浓度)梯度洗脱;制得鸡矢藤苷甲 酯2.5g。
[0065] 实施例4
[0066] 本实施例提供一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，与实施例1的区别在 于，步骤3)以二氯甲烷-甲醇系统为洗脱剂，即分别以二氯甲烷：甲醇(体积比）为12:1，9:1， 7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇为7:1的洗脱液;制得鸡矢藤苷甲酯 2.2g〇
[0067] 实验例
[0068]以实施例1制得的鸡矢藤苷甲酯为样品，经波谱解析和化学方法确定其化学结构 式如式(I)所示;并且测得其纯度为98.6% (面积归一法）。图1为鸡矢藤苷甲酯紫外吸收图； 图2为鸡矢藤苷甲酯质谱图。
[0069]核磁共振(NMR)
[0070] 咕 NMR(400MHz，CD30D): 57.51 (d，J=lHz，1H，H_3)，55.80(t，J = 2Hz，lH，H-7)，S 5.20-5.19(d，J = 6Hz，lH，H-l)，S4.66(d，J = 8Hz，lH，H-r)，S4.55-4.53(dt，J = 2/5Hz，lH， H-6)，M. 35-4.32(br d，J=15Hz，lH，H-10b)，S4.20-4.16(br d，J=15Hz，lH，H-10a)，S 3.65-3.61(dd，J = 2/12，lH，H-6'a)，S3.88-3.85(dd，J = 2/12，lH，H-6'b)，S3.75(s，3H，-COOMe)，S3 ? 03-3 ? 01 (d，J = 2Hz，1H，H-9)，S3 ?0((!，J = lHz，lH，H-5)。
[0071] 13C Mffi(101MHz，CD30D):Sl72.80(s，C-ll)，Sl56.38(s，C-7)，Sl50.04(s，C-3)，S 132.60(s，C-7)，5113.32(s，C-4)，5102.80(s，C-l)，5100.81(s，C-l'），584.78(s，C-6)，S 80.93(s，C-3'），S80.38(s，C-5'），S77.29(s，C-2'），S74.04(s，C-4'），S65.20(s，C-6'），S 63.56(s，C-10)，S54.59(s，C-C00Me)，S49.64(s，C-9)，S48.11(s，C-5)。
[0072] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将水线草用醇溶剂进行提取，得到水线草醇提物； 2) 将所得水线草醇提物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；取正丁醇萃取部 位，浓缩得精提浸膏； 3) 将所述精提浸膏用甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经正相硅胶柱层析，用洗脱 剂进行梯度洗脱，收集洗脱液;所述洗脱剂为氯仿-甲醇洗脱剂，和/或二氯甲烷-甲醇洗脱 剂； 4) 将步骤3)所述洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法进一步纯化，制得鸡矢藤 苷甲酯； 所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，以氯仿-甲醇为 洗脱剂;收集洗脱液后经ODS反相柱层析，以甲醇溶液等度洗脱或者梯度洗脱，收集洗脱液， 制得鸡矢藤苷甲酯； 所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液进制备液相，以甲醇水为流动相进行洗 脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯；所述制备液相采用LC-3000高效液相Thermo C18， (250*21.2mm)制备柱柱。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括将水线草粉碎至60-80目， 加入8-15倍重量的70 %甲醇，搅匀，先超声提取0.5-lh，然后回流提取l-3h，提取温度为60-80°C ;过滤;滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取;共提取三次，合并滤液，减压浓 缩，得到水线草醇提物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述石油醚萃取为将步骤1)所 得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草醇提物与石油醚的重量比例为1-3:4-6; 萃取后保留水部位； 所述乙酸乙酯萃取为将石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚萃取 后所述水部位与乙酸乙酯的重量比例为1-3:4-6;萃取后保留水部位； 所述正丁醇萃取为将乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸乙酯萃取 后所述水部位与正丁醇的重量比例为1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部位。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)将所述精提浸膏用3-5倍重量的 甲醇超声溶解，再进行过滤。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述梯度洗脱包括以氯仿-甲醇 为洗脱剂，分别以氯仿：甲醇体积比为7:1，5:1，3:1进行第一次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为 7 :1的洗脱液;再以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别以氯仿：甲醇体积比为12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1 进行第二次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液;或者以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，分 别以二氯甲烷：甲醇体积比为12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集二氯甲烷： 甲醇为7:1的洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)采用100-200目正相硅胶柱层 析。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述葡聚糖凝胶柱层析，以氯 仿：甲醇体积比60:40为洗脱剂进行洗脱;所述0DS反相柱层析，以30 %甲醇溶液进行等度洗 脱或者以20-50%甲醇溶液进行梯度洗脱。8. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述制备液相分离法先将步骤 3)所得洗脱液经0.22μπι微孔滤膜过滤，再取滤液进制备液相。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)所述制备液相分离法中所述洗脱剂 为25%甲醇水。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将水线草粉碎至60-80目，加入8-15倍重量的70 %甲醇，搅匀，先超声提取0.5-lh，然 后回流提取l_3h，提取温度为60-80°C;过滤；滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提 取;共提取三次，合并滤液，减压浓缩，得到水线草醇提物； 2) 将所得水线草醇提物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；取正丁醇萃取部 位，浓缩得精提浸膏； 所述石油醚萃取为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草醇提 物与石油醚的重量比例为1 -3:4-6;萃取后保留水部位； 所述乙酸乙酯萃取为将石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚萃取 后所述水部位与乙酸乙酯的重量比例为1-3:4-6;萃取后保留水部位； 所述正丁醇萃取为将乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸乙酯萃取 后所述水部位与正丁醇的重量比例为1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部位； 3) 将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经100-200目 正相硅胶柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液； 具体地，所述梯度洗脱以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别以氯仿：甲醇体积比为7:1，5:1，3:1 进行第一次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗脱液;再以氯仿-甲醇为洗脱剂，分别以氯 仿：甲醇体积比为12:1，9:1，7:1，5:1，3:1进行第二次梯度洗脱，收集氯仿：甲醇为7:1的洗 脱液;或者以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，分别以二氯甲烷：甲醇体积比为12 :1，9:1，7:1，5:1， 3:1进行第二次梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇为7:1的洗脱液； 4) 将步骤3)所述第二次梯度洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法进行进一步 纯化，制得鸡矢藤苷甲酯； 所述柱层析分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，用氯 仿：甲醇体积比为60:40的洗脱剂进行洗脱;收集洗脱液后经ODS反相柱层析，用30%甲醇溶 液等度洗脱或者20-50%甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯； 所述制备液相分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液经0.22μπι微孔滤膜过滤，取 滤液进制备液相，以25 %甲醇水为洗脱剂等度洗脱，收集洗脱液，制得鸡矢藤苷甲酯。
【专利摘要】本发明涉及一种水线草中鸡矢藤苷甲酯的提取分离方法，包括将水线草用醇溶剂进行提取，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；浓缩得精提浸膏；甲醇超声溶解，过滤，滤液经正相硅胶柱层析，然后采用柱层析分离法或制备液相分离法进行进一步纯化，得到鸡矢藤苷甲酯。本发明方法分离水线草中鸡矢藤苷甲酯成分的产率高，方法简便快捷，纯度高；所得鸡矢藤苷甲酯可用于制成抗肿瘤的辅助药物，为研发抗癌药物提供一定的应用价值。
【IPC分类】C07H17/04, C07H1/08
【公开号】CN105713056
【申请号】CN201610105418
【发明人】林丽美, 廖端芳, 夏伯候
【申请人】湖南中医药大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年2月25日