在升高的温度下合成肽的改进偶联方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肽合成，并特别涉及改进的固相肽合成（solid phase peptide synthesis，SPPS)的活化和偶联，其以更高速率进行，产生更少不期望的副反应，并且生成 更好结果。
【背景技术】
[0002] 固相肽合成包括当另外的氨基酸被添加到生长肽链时而重复的若干基本步骤。一 固相II指起始氨基酸（之后生长肽链）附着的树脂颗粒。由于链附着到颗粒，所以链就像 是固体颗粒的集合那样被处理（特别是对于洗涤和分离（例如，过滤）步骤），并因此使整 个过程在多数情况下比纯溶液合成更容易。
[0003] SPPS的重复步骤包括脱保护、活化和偶联。脱保护：在各循环开始之前，肽链上最 后的酸保持一被保护II，即，其一氨基II端连接到防止酸发生不希望反应的官能团。当即 将添加下一氨基酸时该一保护基团II由此被除去（一脱保护II步骤）。
[0004] 活化：向反应中添加化合物（一活化剂II )以生成中间氨基酸物质，其更易于偶联 到肽链上脱保护的酸。
[0005] 偶联：活化的物质连接到已有肽链。
[0006] 碳二亚胺活化法
[0007] 或许最常使用且被研究的肽合成活化法均基于碳二亚胺的使用。它们在肽合成中 的使用追溯到1955年，其中N，N'_二环己基碳二亚胺（DCC)被用于促进酰胺键形成。碳二 亚胺包含两个弱碱性氮原子，其将与氨基酸衍生物的羧酸反应形成如图1所示的高度反应 性的〇-酰基异脲。然后形成的〇-酰基异脲可与胺立即反应形成肽键；即，图1中水平显示 的路线。可选地，〇-酰基异脲可转化或被转化为其它活性物质。
[0008] 然而，0-酰基异脲的这些可选的反应中的某一些会促进不期望的途径，其可能导 致或可能不会导致肽键形成，这些不期望的途径也显示于图1中。向非反应性N-酰基脲的 转化（图1中，左下方）防止偶联，而通过噁唑酮形成可发生活化的手性氨基酸的差向异构 化（右下方）。通过使用与碳二亚胺相比过量的氨基酸可形成更加期望的高度反应性的对 称酸酐（图1，左上方）。然而，该方法不期望地消耗额外的氨基酸当量。
[0009] 随着在碳二亚胺活化期间1-羟基苯并三唑（HOBt)作为添加剂的掺入，出现了碳 二亚胺活化法的重大改进。HOBt迅速地将0-酰基异脲转化为高度反应性OBt酯（图1， 右上方），而避免不期望的N-酰基异脲和噁唑酮形成。随后表明1-羟基-7-氮杂苯并三 唑（HOAt)由于7-位氮的邻基效应而是HOBt的有利替代物[161]。许多其它添加剂可被 用于代替HOBt和HOAt，列举若干常见实例，例如，6-氯代-1-羟基苯并三唑（6-Cl-H0Bt)、 2-氰基-2-(羟基亚氨基）乙酸乙酯（0xyma，0xymaPure，ECHA)和1-羟基-2, 5-吡咯烷二 酮（NHS)。
[0010] 典型地，与氨基酸和碳二亚胺的量相比使用1当量的添加剂。然而，最近的研究揭 示，添加剂的量降至低于1当量可能是有用的；S.Nozaki, "Delay of coupling caused by excess additives, 〃J. Pept. Sci.，vol. 12, pp. 147-153, 2006。作者发现通过胺和添加剂之 间的盐形成可妨碍酰化反应。然而，作者还发现，添加剂降至低于1当量减慢了活化速率并 略微增加片段偶联中的差向异构化。
[0011] N，N' -二异丙基碳二亚胺（DIC)作为优选的用于肽活化的碳二亚胺已很大程度上 代替了 DCC。DCC不期望地产生仅在TFA中可溶的脲，进而使其难以用于Fmoc化学。另外， DCC为难以处理并且已报道引起变态反应的蜡质固体。可选地，DIC提供改进其生成的脲在 有机溶剂中的溶解度、报道的变态反应发生率更低以及相对低成本的优点。DIC/HOBt的组 合由于其低成本并最小化副反应同时常规地提供有效偶联而流行。
[0012] 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（一 EDC ||)代表另一流行的选择，并 且这些反应的大多数使用DCC、DIC和EDC的一种或多种来进行。
[0013] 最近对基于苯并三唑的添加剂，例如HOBt、HOAt和6-Cl-H0Bt的分析，已导 致它们被重分类为 1 类爆炸物；K. Wehrstedt, P. Wandre 和 D. Heitkamp, "Explosive properties of l-hydroxybenzotriazoles, 〃J. Hazard Mater, vol. 126,pp. 1-7,2005。苯 并三唑添加剂这样不期望的特点，增加了开发苯并三唑添加剂的合适替代物的兴趣，例如 0xyma(2_氰基_2_(羟基亚氨基）乙酸乙酯；首次报道于1973年（M. Itoh, "Peptides. IV. Racemization Suppression by the Use of Ethyl-2-Hydroximin〇-2-cyanoaceta te and Its Amide，"Bull.Chem.Soc.Jpn.，vol.46，pp. 2219-2221，1973))。更近期地， 用差示扫描量热法（DSC)和加速量热法（ARC)试验了 Oxyma的爆炸性质，Oxyma具有 相比于 HOBt 更有利的结果；R. Subir6s_Funosas, R. Prohens, R. Barbas, A. El-Faham 和 F. Albericio, "Oxyma:An Efficient Additive for Peptide Synthesis to Replace the Benzotriazole-Based HOBt and HOAt with a Lower Risk of Explosion,''Chemistry, vo 1.15,pp.9394-9403, 2009。
[0014] 作为另一潜在的缺点，在室温合成条件下使用基于碳二亚胺的活化法，可导致基 于相对慢的活化过程和更酸性的偶联环境的高水平缺陷。
[0015] 錄[盐活化
[0016] 避免DIC活化的潜在缺点已导致基于鑰盐的活化方法更近期的发展。基于鑰盐 的活化要求使用碱性物质首先使羧酸去质子化，生成羧酸根阴离子，羧酸根阴离子反过来 与鑰盐活化剂反应的。多种鑰盐一其中，〇_(苯并三唑-1-基）-N，N，N'，N' -四甲基脲鑰 六氟磷酸盐（HBTU) ;2-(7_氮杂-1H-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲鑰六氟磷酸盐 (HATU);(苯并三-1-基氧基）三吡咯烷鱗六氟磷酸盐（PyBOP) ; (3-羟基-3H-1，2, 3-三唑 并[4, 5-b]吡啶根合-0)三-1-吡咯烷基-磷六氟磷酸盐（PyAOP);和2-(6_氯代-1H-苯 并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基铵六氟磷酸盐（HCTU) -已表明相比于室温条件下基于碳 二亚胺的活化的改进的偶联。
[0017] 图2说明基于鑰盐的活化途径。
[0018] 在碳二亚胺铟活化时伸用碱件物质
[0019] 在少数报道中，已在室温偶联条件下研究了在基于碳二亚胺的偶联期间 喊性物质的存在。Beyermann 等人（M.Beyermann，P.Henklein，A.Klose，R.Sohr 和 M. Bienert,^Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis, "Int.J. Peptide Protein Res.，vol. 37, pp. 252-256, 1991)此前指出，室温条 件下基于碳二亚胺的活化被受阻胺碱性物质的存在所阻碍。这可发生自：碱性物质优先质 子化，由此阻止在基于碳二亚胺的活化技术中生成0-酰基异脲所必需的第一步，即碳二亚 胺的质子化。然而Beyermann等人也指出，相比于氨基酸，如果在活化过程完成后添加1当 量的相同的受阻胺碱性物质，则可促进室温下的偶联过程。本质上，Beyermann能够通过添 加1当量的碱性物质模拟导致相似结果的随后的鑰盐酰化条件和碳二亚胺活化方法。
[0020] 稍后，Carpino 等人（L. Carpino,和 El-Faham A.，〃The Diisopropylcarbodiimid e/l-Hydroxy-7-azabenzotriazole System:Segment Coupling and Stepwise Peptide As sembly, "Tetrahedron, vol. 55, pp. 6813-6830, 1999)表明，在基于碳二亚胺的偶联中，例如 2, 4, 6-三甲基吡啶（TMP)等显著较弱的碱性物质以相对于氨基酸的1或2当量存在，可改 进活化和偶联步骤二者，而不干扰碳二亚胺的质子化。在同一研究中，Carpino等人（1999) 也指出，在困难的5聚体（5-mer)序列中，随后的肽酰化步骤中，以对氨基酸的3或4当量 使用较强的碱性物质DIEA，显著地比较弱的碱性物质TMP更有效。Carpino等人（1999)也 指出（与Beyermann等人一致），强碱性物质的存在阻碍活化过程，并由此只应在随后的酰 化步骤中存在。
[0021] 由此，Carpino等人（1999)和Beyermann等人都教导，在相同情况下，通过使用前 活化步骤，接着在存在量为相对于活化氨基酸1-4当量的强碱性物质（例如DIEA)的存在 下随后酰化，室温基于碳二亚胺的偶联法可产生最优结果。作为理论基础，使用相比于活化 氨基酸的至少1当量的碱性物质，模拟通常使用2当量碱性物质的基于鑰盐的技术。在鑰 盐的情况下，需要第一当量用于活化时必需的羧酸根阴离子形成，而第二当量的存在是用 于促进随后的酰化步骤。
[0022] 然而，Beyermann注意到，此方法仅与使用鑰盐（B0P、TBTU)观察到的合成结果相 符，而Carpino(1999)并没有在碱性物质的存在下在鑰盐偶联和基于碳二亚胺的偶联之间 进行直接比较。由此，Carpino (1999)和Beyermann等人一起教导，通过在室温下掺入相似 量的碱性物质，基于碳二亚胺的活化后的酰化步骤可与基于鑰盐的活化后的酰化步骤相似 地进行。
[0023] 然而偶联过程中碱性物质的使用不太理想，因为它们可导致不期望的副反应。 Collins 等人（J. Collins, K. Porter, S. Singh和G. Vanier, 〃High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS)，"Org. Lett.，vol. 16, pp. 940-943, 2014)表明，在没有任 何碱性物质的存在下，在基于碳二亚胺的偶联法下，90°C下的半胱氨酸差向异构化最低。 Palasek等人（S. Palasek, Z. Cox和 J. Collins,''Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis, ^J. Pept. Sci.，vol. 13, pp. 143-148,2007)表明，当DIEA和NMM以2当量存在时，鑰盐活化法下可发 生显著的半胱氨酸差向异构化。此外Fmoc保护基对DIEA逐渐不稳定，并且此不稳定性在 更高的温度下可增加，导致不期望的插入序列（其可难以分离）。
[0024] 在另外的研究中，Perich 等人（J. Perich, N. Ede, S. Eagle 和 A. Bray, "Synthesis of phosphopeptides by the Multipin method:Evaluation of coupling methods for the i