一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物及其二聚物的合成和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，涉及一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物；本发明同时 还涉及该抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 在人类发展的长河中，细菌感染曾经夺去无数人的生命。自从青霉素问世以来，大 量的抗菌药物不断涌现，在细菌感染疾病的治疗中发挥了极大的作用。但是由于抗菌药物 的不合理应用，导致细菌耐药频繁发生，甚至耐药倾向性产生的速度远远超出抗菌药物的 研发速度。细菌耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题。特别是"超级细菌"的出现，使 人类面临无药可用的窘境。因此除了规范抗菌药物的使用外，迫切需要开发具有新作用机 制并且不受传统耐药机制影响的抗菌药物。
[0003] 吖啶分子是一个多芳香环化合物，其能够通过插入到DNA中而诱导细胞死亡。 目前，已经有多种吖啶类似物被合成，并用于抗细菌、抗疟疾甚至是抗肿瘤研宄[Acta poloniae pharmaceutica, 2012;69:3]。早在 1912 年，Ehrlich 和 Benda 就把卩丫啶分子运 用于抗菌领域。而在1917年，基于吖啶分子的抗菌药物便成功地上到临床研宄[Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2001 ;47:1]。但是，此后由于青霉素的兴起，占据了抗菌药 的主要市场，叮啶类药物就逐渐的离开了人们的视线。但是近些年，由于耐药性细菌的广 泛发生，卩丫啶类药物又引起了人们的广泛关注[The Open Medicinal Chemistry Journal, 2011;5:11]。
[0004] 核定位序列（NLS，PKKKRKV)是一段有7个氨基酸残基组成的多肽片段，NLS作为 病毒SV40的T抗原的一个片段，因其具有转运细胞外活性物质进入细胞核的能力而为人们 所熟知[Advanced Drug Delivery Reviews, 2007;59:698]。研宄发现，尽管作用机制不 清楚，但是NLS对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都表现出一定的抑制作用[Antimicrobial agents and chemotherapy, 2006;50:1118]〇
[0005] 迄今发现的抗生素基本上都是通过单一作用机制抑杀细菌，这就很容易导致细菌 对这类药物产生耐药性。因此发展具有多靶点的抗生素药物对于治疗耐药细菌感染具有重 要意义。另外，由于具有多个作用靶点，细菌也不容易对这类药物产生耐药性。
【发明内容】
[0006] 为了发展不易受传统耐药机制影响的抗菌药物，针对现有技术中存在的问题， 本发明的一个目的是提供一种具有多靶点的多肽偶联物抗菌药物Acr3-NLS及其二聚物 (Acr3-NLS)2; 本发明的另一个目的是提供了具有多靶点的多肽偶联物抗菌药物Acr3-NLS及其二聚 物（Acr3-NLS)2的合成方法； 本发明还提供一种以抗菌多肽偶联物为活性成分在制备抗菌药物中的应用。
[0007] -、具有多靶点的抗菌多肽偶联物及其合成 1、具有多靶点的抗菌多肽偶联物的结构 本发明具有多靶点的抗菌多肽偶联物，是基于吖啶分子Acr和核定位序列NLS构建的 具抗菌多肽偶联物Acr3-NLS,其结构序列如下：
其中所用氨基酸都为L型氨基酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸，V为缬氨酸，C 为半胱氨酸。
[0008] 2、具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成 本发明具有多靶点的抗菌多肽偶联物的合成，是在具有正电荷多肽序列Pro-Lys-Lys- Lys-Arg-Lys-Val-Cys-NHj^ N端引入侧链含有吖啶基团的赖氨酸（Lys (acridine))。其具 体合成步骤如下： (1) 含有吖啶基团氨基酸Fmoc-Lys (Acr)的合成 a. 9-Phenoxyacridine的合成：氩气保护下，使苯|^、Na0H、9-氯卩丫啶以10:1. 5:1的摩 尔比，于95~105°C反应I. 5~2h，加入NaOH溶液终止反应；然后在室温下静置10~12h，得到 黄色沉淀；过滤，水洗，抽干，即得产物9-Phenoxyacridine ; b· Fmoc-Lys (Acr)的合成：氩气保护下，使 Fmoc-Lys-〇H、苯酷、9-phenoxyacrudine 以1:12:2的摩尔比，于55~65°C反应~5h;用无水乙醚随沉淀，过滤，洗涤，即得产物 Fmoc-Lys(Acr)； (2) Acr3-NLS的固相合成： a. 树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂加入到二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后 减压抽干溶剂； b. 脱Fmoc保护：将预处理的树脂加入到脱保护试剂中，搅拌2min后抽干，重复使 Fmoc基团完全脱除，然后用DMF洗涤除净脱保护试剂；所述脱保护试剂为哌啶与DMF以 1:4~1:5体积比的混合物； c. 缩合：氩气保护下，将Fmoc保护氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、0-苯并三氮 唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀，然后加入 脱Fmoc保护的树脂进行搅拌反应；通过茚检试剂检测反应程度，待反应完全后用DMF重复 洗涤除去未反应的试剂；所述氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲-六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的摩尔比为1: 1:1:2 ;氨基酸与脱Fmoc保护的树脂的 摩尔比为3:1~4:1 ; d. 肽链的延长：重复b和c两个过程，按照设计要求将L型氨基酸脯氨酸，赖氨酸，精 氨酸，缴氨酸，半胱氨酸及Fmoc-Lys (Acr)连接到树脂上，直至接肽完成为止； e. 肽链从树脂上的切割：按照步骤b的方法将最后一个连接的氨基酸的Fmoc基团 完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应 1. 5~3小时，收集切割试剂并减压旋干，用乙醚进行震荡沉淀，静置后先去除上清的乙醚，再 用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相；水相经冷冻干燥，得白色固体粉末粗肽；所述切 割剂是由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醚、水以82. 5:5:5:2. 5:5体积比的混混合 物；切割剂的加入量为每克肽树脂加入10~25mL ; f.粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度1〇~20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过 Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的 肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色的纯 肽固体粉末即为Acr3-NLS产品。
[0009] 上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成 功合成了 Acr3-NLS。Acr3-NLS的理化特征见表1。
[0010] 二、多肽偶联物抗菌药物二聚物（Acr3-NLS)2及其合成 1、二聚物（Acr3-NLS)2的结构 本发明多肽偶联物抗菌药物二聚物（Acr3-NLS)2，是将两个多肽偶联物抗菌药物 Acr3-NLS分子通过二硫键相连形成的二聚物（Acr3-NLS)2。其结构式如下：
其中所用氨基酸都为L型氨基酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸，V为缬氨酸，C 为半胱氨酸。
[0011] 2、二聚物（Acr3-NLS)2的合成 (1)抗菌肽Acr3-NLS序列中半胱氨酸侧链巯基的活化：将二硫二吡啶溶于甲醇溶液中， 将具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS溶于甲醇/水中，并加入上述二硫二吡啶的甲醇 溶液中，反应1〇~16 h，利用C18反相高效液相柱层析纯化，得到巯基活化的Acr3-NLS ;二硫 二吡啶与具有多靶点的抗菌多肽偶联物Acr3-NLS的摩尔比为10:1~15:1。
[0012] (2 )抗菌多肽二聚物的合成：将巯基活化的Acr3-NLS与纯化的Acr3-NLS以 1:1. 2~1:1. 6的摩尔比溶于甲醇/水中，反应10~16 h，通过HPLC进行纯化，得到二聚物 (Acr3-NLS)2O
[0013] 上述甲醇/水中，甲醇与水的体积比为1:1~1:10。
[0014] 上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致，表明成 功合成了 Acr3-NLS二聚物（Acr3-NLS)2。二聚物（Acr 3-NLS)