胰高血糖素样肽-1受体激动剂制备治疗肺动脉高压药物的应用
【专利摘要】本发明首次发现胰高血糖素样肽?1受体激动剂治疗肺动脉高压的新用途。本发明用多种实验证实该类药物能够有效地降低细胞糖酵解水平，抑制肺血管细胞的异常增生，显著减轻肺血管重构，从而降低肺血管阻力和肺动脉压力,治疗肺动脉高压。
【专利说明】膜高血糖素样化-1受体激动剂制备治疗肺动脉高压药物的 应用
[0001 ] 本申请针对申请号为201510428001.0申请日为2015年7月20日的中国专利申请提 出优先权请求。
技术领域：
[0002] 本发明设及膜高血糖素样肤-1受体激动剂的新用途，特别设及其在制备肺动脉高 压治疗药物方面的应用。
【背景技术】：
[0003] 膜高血糖素样肤-UW下亦简称化P-1)是小肠 k细胞在肠腔内营养物质的刺激下 所分泌产生的内源性激素。
[0004] 现有技术中的报道中，GLP-1主要是对糖代谢的作用，包括刺激膜岛素释放，阻止 膜高血糖素分泌，减慢胃排空，W及增加饱腹感等，运些效应的产生是通过化P-1受体实现 的。化P-1受体属于G蛋白偶联受体，分布于膜岛、肾脏、脑、屯、脏、胃肠道和肺血管等组织或 器官。内源性化P-1作用时间有限，迅速被DDP-4酶降解。因此，人工合成的能够抵抗DDP-4降 解的化P-1类似物先后被研发出来，作为化P-1受体激动剂用于2型糖尿病的治疗，如：艾塞 那肤、利拉鲁肤和利西拉来等。此外，利拉鲁肤近期还被美国食品和药品管理局(FDA)批准 用于肥胖症治疗。
[0005] 肺动脉高压指由各种原因引起的肺血管床结构和/或功能的改变，导致W肺血管 阻力进行性升高为特点的临床综合征。在肺动脉高压的形成和发展机制中，致死性、难治性 的进行性肺血管重构具有极为重要的作用。肺血管重构W平滑肌细胞增殖和内皮细胞功能 障碍为主要特征，可W导致肺动脉血管闭塞，引起肺血管阻力和肺动脉压力明显增高，进而 可诱发右屯、室功能不全。
[0006] 肺动脉高压预后较差，平均存活时间仅为2.8年，其早期诊断和治疗仍然是目前面 临的临床难题。肺动脉高压药物治疗十分困难，目前临床用药，其治疗机制主要是通过扩张 肺血管来降低肺血管阻力和肺动脉压力，如:巧通道阻滞剂、前列环素、憐酸二醋酶-5抑制 剂等，上述药物仅缓解压力，但对于抑制细胞增殖和血管重构没有明确的作用。
[0007] 尽管已知利拉鲁肤等GLP-1受体激动剂对糖代谢的调节作用可通过激活AMPK通路 实现，而AMPK作为机体调节代谢的核屯、分子被激活可促进分解代谢，下调合成代谢，恢复能 量代谢平衡，同时可降低HIF-la表达，抑制糖酵解水平的异常升高。但目前并未见到化P-1 受体激动剂用于肺高压治疗的研究报道。
【发明内容】
[000引本发明的最终目的是提供一种肺动脉高压治疗药物，直接目的是发现化P-1受体 激动剂的新的功能一-用于肺动脉高压的治疗，特别是在有效抑制异常的细胞增生，减轻 肺血管重构方面的作用。
[0009 ]发明人基于W下认识和分析，设计了本发明的技术方案：
[0010] 肺血管平滑肌细胞异常增殖与糖代谢异常有着密切的关系。对于肺动脉高压患 者，由于缺氧诱导因子HIF-la的表达和活化异常增强，会引起一系列与糖代谢有关的酶，如 葡萄糖转运体、己糖激酶、乳酸脱氨酶A、丙酬酸脱氨酶激酶和丙酬酸脱氨酶等的改变，从而 导致肺血管细胞的葡萄糖代谢方式从正常的线粒体有氧氧化向异常的糖酵解转化，糖酵解 不断增强，糖酵解的中间代谢产物可为细胞增殖合成DNA等提供大量底物，而且，细胞氧耗 与能量合成平衡被打破，能量代谢效率下降，线粒体功能障碍，从而破坏了肺血管平滑肌细 胞的增殖与调亡之间的动态平衡，导致或促进肺血管重构和肺动脉高压的形成。
[0011] 本发明人认为，如果能应用化P-1受体激动剂，通过其对细胞糖代谢的调节作用， 抑制细胞糖酵解，促进线粒体功能，恢复细胞代谢效率，就有可能控制或逆转肺血管平滑肌 细胞和内皮细胞的异常增殖，从而延缓甚至逆转肺血管重构，达到治疗肺动脉高压的目的。
[0012] 因此，推测运类药物有可能用于肺动脉高压的治疗。
[0013] 本发明用动物实验、体外分子生物学实验等多方实验验证了上述设想，首次证实 GLP-1受体激动剂可W作为肺动脉高压治疗药物，特别是能够有效地抑制异常的细胞增生， 减轻肺血管重构。
[0014] 所述实验如下：
[001引动物实验
[0016] 经典大鼠肺高压模型证明，与不用药的对照组相比，GLP-1受体激动剂治疗组可明 显降低肺高压动物模型的肺动脉压力，并明显降低肺血管阻力和右屯、肥厚程度；
[0017] 体外分子生物学实验
[0018] 大鼠肺组织切片染色表明，与不用药的对照组相比，GLP-1受体激动剂治疗组可明 显减轻肺血管肌化程度和炎性细胞浸润程度，提示肺高压典型病理表现肺血管重构减轻； 大鼠肺组织碳酸酢酶免疫组化染色，治疗组大鼠肺组织碳酸酢酶水平较不用药对照组相比 显著下降，提示组织缺氧程度减轻；
[0019] 大鼠肺组织蛋白印记检测显示，治疗组较不用药对照组葡萄糖转运体蛋白1 (Glut-1)表达下降，pAMPK/AMPK比例明显升高;且表皮生长因子刺激人肺血管平滑肌细胞 模拟重构肺血管细胞模型证明，GLP-1受体激动剂可显著抑制人肺血管平滑肌细胞增生、降 低细胞葡萄糖摄取W及糖酵解终产物乳酸的产生，提示化P-1受体激动剂可有效干预细胞 代谢，抑制糖酵解。
[0020] 上述各项实验均证实:GLP-1受体激动剂能够通过对细胞糖代谢方式进行调节。其 药理机制是:有效地降低细胞糖酵解水平，抑制肺血管细胞的异常增生，显著减轻肺血管重 构，从而降低肺血管阻力和肺动脉压力，能够达到治疗肺动脉高压的目的。
[0021] 而现有技术中治疗肺动脉高压的药物主要是通过扩张肺血管来降低肺血管阻力 和肺动脉压力，对于抑制细胞增殖和血管重构没有明确的作用。而本发明的药物从根本上 解决了问题。
[0022] 本发明所述的化P-1受体激动剂包括但不限于艾塞那肤（exenatide)、利拉鲁肤 (liraglutide)和利西拉来（lixisenatide)，阿必鲁肤（albiglutide)，杜拉鲁肤 (dulaglutide)。
[0023] 通过本发明给予的启示，本领域技术人员可W预见：能够对细胞糖代谢进行调节 的GLP-1受体激动剂，都可W达到本发明的目的。
【附图说明】
[0024] 图1大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肤治疗组肺动脉压力测定结 果的比较，显示利拉鲁肤治疗组的肺动脉压力明显低于肺高压模型未用药组。
[0025] 图2大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肤治疗组肺血管阻力测定结 果的比较，显示利拉鲁肤治疗组的肺血管阻力明显低于肺高压模型未用药组。
[00%]图3大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肤治疗组右屯、肥厚指数测定 结果的比较，显示利拉鲁肤治疗组右屯、肥厚程度明显低于肺高压模型未用药组。
[0027]图4大鼠肺高压模型组和利拉鲁肤治疗组分别进行肺组织弹性纤维EVG染色，检测 肺血管肌化程度。结果显示:箭头所指为重构的弹性纤维层，利拉鲁肤治疗组肺血管肌化程 度较肺高压模型组明显减轻。
[00%]图5大鼠肺高压模型组和利拉鲁肤治疗组分别进行肺组织CD68染色，检测炎性细 胞浸润程度。结果显示：箭头所指为CD68阳性的细胞，即浸润在肺血管周围的炎性细胞，利 拉鲁肤治疗组炎性细胞浸润程度较肺高压模型组明显减轻。
[0029] 图6 Glut-l、pAMPK/AMPK表达蛋白印记检测，结果显示:利拉鲁肤治疗组较肺高压 组大鼠肺组织pAMPK/AMPK比例明显升高，提示AMPK憐酸化程度增高，Glut-1表达显著减少。
[0030] 图7肺组织碳酸酢酶免疫组化染色，结果显示:箭头所指为碳酸酢酶免疫组化染色 阳性的肺血管组织，利拉鲁肤治疗组较肺高压组大鼠肺组织碳酸酢酶水平显著下降。
[0031] 图8大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肤治疗组肺动脉压力测定结 果的比较，显示艾塞那肤治疗组的肺动脉压力明显低于肺高压模型未用药组。
[0032] 图9大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肤治疗组肺血管阻力测定结 果的比较，显示艾塞那肤治疗组的肺血管阻力明显低于肺高压模型未用药组。
[0033] 图10大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肤治疗组右屯、肥厚指数测定 结果的比较，显示艾塞那肤治疗组右屯、肥厚程度明显低于肺高压模型未用药组。
【具体实施方式】
[0034] W下实施例所用的药物仅用于举例说明本发明，并不限定本发明所称的化P-1受 体激动剂的范围。
[0035] 实施例1 GLP-1受体激动剂利拉鲁肤对肺高压动物的治疗作用
[0036] 1、实验目的
[0037] 通过建立肺高压动物模型，并利用化P-1受体激动剂利拉鲁肤进行治疗，通过对大 鼠肺动脉血流动力学和右屯、肥厚指标的检测，观察利拉鲁肤的疗效。
[0038] 2、实验动物和实验方法
[0039] 选择体重为220-230g的雄性SD大鼠随机分为Ξ组，分别为健康对照组、肺动脉高 压模型未用药组和药物治疗组，每组6只。健康对照组仅皮下注射生理盐水。未用药组和药 物治疗组均皮下注射野百合碱(Sigma公司)诱导肺动脉高压形成，野百合碱单次注射，注射 剂量为60mg/Kg。药物治疗组于野百合碱注射后7天开始，再连续14天每日腹腔注射利拉鲁 肤(Novo Nordisk公司）治疗，剂量为0.4mg/Kg。
[0040] 野百合碱单次注射后Ξ周，利用右屯、导管测量各组大鼠的右屯、和肺动脉血流动力 学指标。大鼠经腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后，将预制导管连接压力测量 仪，经右颈外静脉插管，经上腔静脉到达右房、右室、肺动脉，分别记录右屯、房、右屯、室、肺动 脉压力完毕后，将导管退入至右屯、室，固定。取左屯、导管经颈动脉插管，测量体循环动脉压， 进入左屯、室，测量左屯、压力，记录完毕后撤出左屯、导管，再经相同路径插入溫度测量导管， 进行热稀释法屯、输出量测量。从右屯、导管注入固定体积冰盐水Ξ次，记录每次注入生理盐 水的体积和溫度，并记录左屯、室内溫度变化。根据平均肺动脉压、屯、输出量计算肺血管阻 力。
[0041] 血流动力学指标测量完毕后，撤出导管，解剖大鼠，取材。仔细分离左右屯、室并称 重，并计算右屯、肥厚指数，右屯、肥厚指数=右屯、质量/左屯、和室间隔质量之和。
[0042] 3、实验结果
[0043] 1)健康对照组大鼠平均肺动脉压力为18.78 ± 3.60mmHg，未用药组和药物治疗组 的平均肺动脉压分别为44.90 ± 11.57mmHg和30.86 ± 4.85mmHg，未用药组压力较健康对照 组明显升高，而药物治疗组明显低于未用药组，两组间有显著的统计学差异(P<〇.001，图 1)；
[0044] 2)健康对照组大鼠肺血管阻力为0.19±0.09mmHg/mL/min，未用药组和药物治疗 组的肺血管阻力分别为0.40 ±0.02mmHg/mL/min和0.31 ±0.03mmHg/mL/min，未用药组阻力 较健康对照组明显升高，药物治疗组明显低于未用药组，两组间同样有显著的统计学差异 (P<0.05,图2)。
[0045] 3)健康对照组、未用药组和药物治疗组的体循环动脉压分别为113. 56 ± 26.38111111化、103.24±3.93111111化和109.16±9.15111恤旨，屯、输出量分别为94.47±19.5311117 min、89.85 ±4.48mL/min和91.54 ± 10.77mL/min，Ξ组间均无明显的统计学差异（均为P〉 0.05)。
[0046] 4)此外，健康对照组、未用药组和药物治疗组的右屯、肥厚指数分别为0.26±0.01、 0.44 ± 0.10和0.34 ± 0.04，未用药组右屯、明显肥厚，而药物治疗组右屯、肥厚程度明显低于 未用药组，有显著的统计学差异(P<〇.01，图3)。
[0047] 4、实验结论
[004引对比未用药的肺高压模型组，利拉鲁肤能够明显降低平均肺动脉压和肺血管阻 力，而体循环动脉压、屯、输出量未受到影响。且能够明显减轻右屯、肥厚程度。
[0049]表1各实验组血流动力学指标和右屯、肥厚指标的比较
[(Κ)加 ]
[0052]实施例2 GLP-1受体激动剂艾塞那肤对肺高压动物的治疗作用 [0化3] 1、实验目的
[0054] 通过建立肺高压动物模型，并利用化P-1受体激动剂艾塞那肤进行治疗，通过对大 鼠肺动脉血流动力学和右屯、肥厚指标的检测，观察艾塞那肤的疗效。
[0055] 2、实验动物和实验方法
[0056] 选择体重为220-230g的雄性SD大鼠随机分为Ξ组，分别为健康对照组、肺动脉高 压模型未用药组和药物治疗组，每组6只。健康对照组仅皮下注射生理盐水。未用药组和药 物治疗组均皮下注射野百合碱(Sigma公司)诱导肺动脉高压形成，野百合碱单次注射，注射 剂量为60mg/Kg。药物治疗组于野百合碱注射后7天开始，再连续14天每日腹腔注射艾塞那 肤(As traZeneca公司）治疗，剂量为1 Oyg/Kg。
[0057] 野百合碱单次注射后Ξ周，利用右屯、导管测量各组大鼠的右屯、和肺动脉血流动力 学指标。大鼠经腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后，将预制导管连接压力测量 仪，经右颈外静脉插管，经上腔静脉到达右房、右室、肺动脉，分别记录右屯、房、右屯、室、肺动 脉压力完毕后，将导管退入至右屯、室，固定。取左屯、导管经颈动脉插管，测量体循环动脉压， 进入左屯、室，测量左屯、压力，记录完毕后撤出左屯、导管，再经相同路径插入溫度测量导管， 进行热稀释法屯、输出量测量。从右屯、导管注入固定体积冰盐水Ξ次，记录每次注入生理盐 水的体积和溫度，并记录左屯、室内溫度变化。根据平均肺动脉压、屯、输出量计算肺血管阻 力。
[005引血流动力学指标测量完毕后，撤出导管，解剖大鼠，取材。仔细分离左右屯、室并称 重，并计算右屯、肥厚指数，右屯、肥厚指数=右屯、质量/左屯、和室间隔质量之和。
[0化9] 3、实验结果
[0060] 1)健康对照组大鼠平均肺动脉压力为14.83 ± 3.27mmHg，未用药组和药物治疗组 的平均肺动脉压分别为36.37 ± 5.61mmHg和30.11 ± 2.17mmHg，未用药组压力较健康对照组 明显升高，而药物治疗组明显低于未用药组，两组间有显著的统计学差异(P<〇.01，图8); [0061 ] 2)健康对照组大鼠肺血管阻力为0.16 ± 0.03mmHg/mL/min，未用药组和药物治疗 组的肺血管阻力分别为ο. 39 ±0.05mmHg/mL/min和ο. 31 ±0.0 lmmHg/mL/min，未用药组阻力 较健康对照组明显升高，药物治疗组明显低于未用药组，两组间同样有显著的统计学差异 (P<0.001，图9)。
[0062] 3)健康对照组、未用药组和药物治疗组的体循环动脉压分别为102.33 ± 9.02111111化、98.31±10.76111111化和98.60±9.91111111化，屯、输出量分别为95.20±4.5611117111111、 92.20 ± 7.49mL/min和96.08 ±8.12mL/min，Ξ组间均无明显的统计学差异(均为P〉0.05)。
[0063] 4)此外，健康对照组、未用药组和药物治疗组的右屯、肥厚指数分别为0.27±0.03、 0.43 ± 0.07和0.33 ± 0.04，未用药组右屯、明显肥厚，而药物治疗组右屯、肥厚程度明显低于 未用药组，有显著的统计学差异(P<〇.01，图10)。
[0064] 4、实验结论
[0065] 对比未用药的肺高压模型组，艾塞那肤能够明显降低平均肺动脉压和肺血管阻 力，而体循环动脉压、屯、输出量未受到影响。且能够明显减轻右屯、肥厚程度。
[0066] 表2各实验组血流动力学指标和右屯、肥厚指标的比较
[0067]
[006引实施例3 GLP-1受体激动剂对肺血管重构的影响
[0069] 1、实验目的
[0070] 体外组织检测评价利拉鲁肤治疗对肺血管重构的影响。
[0071] 2、实验方法
[0072] 上述各组大鼠处死后，取出新鲜肺组织浸泡在10%福尔马林溶液中过夜，然后换 70%乙醇保存，石蜡包埋切片，进行弹性纤维EVG染色测量肺血管肌化程度和CD68染色测量 炎性细胞浸润程度。
[0073] 3、实验结果
[0074] 肺高压模型未用药组和药物治疗组的肺血管肌化程度分别为66.96±6.28%和 49.78±4.83%，利拉鲁肤治疗后肺血管肌化程度明显减低，两组有显著的统计学差异(P< 0.001，图4);未用药组和药物治疗组的CD68阳性细胞数分别为20.01 ±2.51个/mm哺9.28 ±5.93个/mm2,利拉鲁肤治疗后，炎性细胞浸润明显减轻，有显著的统计学差异(P<0.05,图 5)。
[00巧]4、实验结论
[0076] 对比肺高压模型组，利拉鲁肤治疗后肺血管肌化和炎性细胞浸润等肺血管重构病 理变化明显减轻。
[0077] 实施例4 GLP-1受体激动剂对细胞增生的影响 [007引1、实验目的
[0079] 通过进行体外细胞增殖实验(BrdU染色)评价利拉鲁肤对肺血管平滑肌细胞增生 的影响。
[0080] 2、实验方法
[0081 ]平底透明96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第Ξ至五代）（L0NZA公司），细胞密度 约5000个/mL，每孔体积10化1，普通10%牛血清培养液，37摄氏度、5%C02培养过夜。第二 日，移除陈旧培养液，换成0.05 %牛血清细胞培养液培养24小时，使其生长速率均一化。
[0082] 24小时后，用含10%牛血清无生长因子的培养液配制浓度为50ng/ml的表皮生长 因子(PDGF)溶液、PDGF (50ng/ml) +利拉鲁肤(20μΜ)溶液和 PDGF (50ng/ml) +利拉鲁肤(50μΜ) 溶液分别作为培养液，将人肺血管平滑肌细胞分成对照组、PDGF组和利拉鲁肤治疗组(PDGF +利拉鲁肤），每组η = 6，37摄氏度、5 % C〇2培养。48小时后向各组加入化加继续培养24小时 至实验终点72小时。移除培养液，加入细胞固定液固定细胞30分钟后，移除固定液加入抗体 室溫解育1小时，洗一次，加入二抗室溫解育30分钟后洗两次，加入10化1反应底物，暗室室 溫解育30分钟后加入反应终止溶液10化1，使用多功能微孔板检测仪(Promega公司），450皿 吸收峰读数。
[0083] 3、实验结果
[0084] PDGF组细胞增生速率为对照组细胞1.5倍，而20μΜ和50μΜ利拉鲁肤治疗组细胞增 生速率仅分别是对照组细胞1.27倍和1.26倍，利拉鲁肤治疗组较PDGF组细胞增生速率显著 下降，其差异均有显著的统计学意义(P<〇.05)。
[0085] 另外，为了研究利拉鲁肤治疗在正常条件下对健康细胞增生有无影响，在相同细 胞条件下，无 PDGF刺激，进行细胞增生化加染色，20ιχΜ和SOiiM利拉鲁肤治疗72小时，和对照 组细胞相比，细胞增生速率差异无显著统计学意义(P〉〇.05)。
[00化]4、实验结论
[0087] 利拉鲁肤能够显著降低PDGF诱导的肺血管平滑肌细胞增生，而对正常条件下的健 康细胞无明显的影响。
[0088] 实施例5 GLP-1受体激动剂对体外细胞葡萄糖摄取的作用
[0089] 1、实验目的
[0090] 通过巧光标记2-N-[7-硝基苯-2-乙二酸-3,4-二径氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG) 摄取实验测定GLP-1受体激动剂对肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取的影响
[0091] 2、实验方法
[0092] 平底黑色96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第Ξ至五代KL0NZA公司），细胞密度 约5000个/mL，每孔10化1，普通10 %牛血清培养液，37摄氏度，5 % C〇2培养过夜。移除陈旧培 养液，用含10 %牛血清无生长因子的培养液配置PDGF(5化g/ml)和PDGF(5化g/ml)+利拉鲁 肤(50μΜ)溶液分别作为培养液，
[0093] 将细胞分成对照组、表皮生长因子(PDGF)组及治疗组(PDGF+利拉鲁肤），每组η = 6,37摄氏度、5%C02培养。72小时实验终点前3小时，向各组加入100μl2-NBDG(Cayman 化emical公司），最终浓度l(K)μg/ml，解育3小时后离屯、96孔板(400xg，室溫5分钟），小屯、吸 去上清，憐酸盐缓冲液洗Ξ次后，加入100μΙ分析缓冲液，使用多功能微孔板检测仪 (Promega公司），激发波长485nm，发射波长535nm，巧光读数获取巧光强度。用细胞质量校正 结果。
[0094] 3、实验结果
[00M]对照组、PDGF组、利拉鲁肤治疗组人肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取水平校正巧光 强度分别为 3225.86 ± 787.93、6190.32 ± 980.76 和 3868.20 ± 14：34.26。72 小时 PDGF 刺激诱 导肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取增加，而利拉鲁肤显著减少了人肺血管平滑肌细胞葡萄糖 摄取(P<〇.〇5)
[0096] 4、实验结论
[0097] 人肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取经治疗后显著减低，表示利拉鲁肤可调节细胞葡 萄糖代谢，进而有可能抑制肺血管增生、改善肺血管重构。
[0098] 实施例6GLP-1受体激动剂对细胞糖酵解水平的作用
[0099] 1、实验目的
[0100] 通过测量细胞外环境乳酸水平，检测对细胞糖酵解水平的影响。
[0101] 说明：乳酸为细胞糖酵解过程终产物，并被释放至细胞外环境，被分泌至细胞外环 境的乳酸水平与细胞糖酵解水平呈正相关，因此，采用对利拉鲁肤治疗后的人肺血管平滑 肌细胞外环境乳酸水平的检测，可W研究利拉鲁肤对细胞糖酵解过程W及肺血管重构的影 响。
[0102] 2、实验方法
[0103] 平底透明96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第Ξ至五代）（L0NZA公司），细胞密度 约5000个/mL，每孔10化1，普通10%牛血清培养液，37摄氏度、5%C02培养过夜。移除陈旧培 养液，用含10%牛血清无生长因子的培养液配置PDGF(50ng/ml)，PDGF(50ng/ml)+利拉鲁肤 (50μΜ)溶液分别作为培养液，细胞分成对照组、表皮生长因子(PDGF)组及治疗组(PDGF+利 拉鲁肤），每组η = 6，37摄氏度、5 % C〇2培养72小时。实验终点离屯、96孔板（100化pm，室溫5分 钟），每孔分别取扣1上清测量各组细胞乳酸水平。依照厂家提供试剂及实验方法步骤，另取 一空96孔板，分别放入不同浓度梯度的乳酸标准样品（Cayman化emical公司）及相对应组 别每孔扣1细胞上清液，向所有各孔加入100μΙ反应液后，将96孔板置于摇床室溫缓慢反应 30分钟。反应30分钟结束后，使用多功能微孔板检测仪(Promega公司），49化m吸收峰读数。 根据乳酸脱氨酶催化氧化乳酸反应生成丙酬酸过程中形成NADH还原底物，利用乳酸标准样 品，测量吸收峰490nm强度计算相应乳酸水平。
[0104] 3、实验结果
[0105] 经利拉鲁肤治疗后的人肺血管平滑肌细胞外环境的乳酸水平为2.47±0.32mM，较 PDGF刺激增生的人肺血管平滑肌细胞外乳酸水平(3.12±0.54mM)显著降低(P<0.05)。
[0106] 4、实验结论
[0107] 利拉鲁肤降低人肺血管平滑肌细胞糖酵解水平，表示利拉鲁肤可调节肺血管的糖 代谢失衡，促进葡萄糖代谢效率，进而改善肺血管重构。
[010引实施例7 GLP-1受体激动剂分子生物学实验检测
[0109] 1、实验目的和方法
[0110] 为验证上述利拉鲁肤对肺动脉高压的疗效，W及对细胞增生W及葡萄糖代谢的影 响是否与AMPK通路激活并影响下游缺氧诱导因子及葡萄糖转运体有关，分别应用蛋白质印 记和免疫组织化学染色实验检测AMP时溝酸化水平、缺氧诱导因子直接相关的细胞缺氧标记 物碳酸酢酶和葡萄糖转运体蛋白1(W下亦简称Glut-1)。
[0111] (1 )Glut-l、pAMPK/AMPK 表达蛋白印记检测
[0112] 新鲜肺组织取出后立即放入液氮保存，利用憐酸盐裂解液(含lOOmM憐酸根，其中 憐酸氨二钟:憐酸二氨钟=3:1，ImM邸TA，ImM二硫苏糖醇，蛋白酶抑制剂），电动低溫匀浆， 12000xg，4摄氏度离屯、20分钟后保留上清液，并进行蛋白定量后，可根据蛋白印记基本实验 步骤进行目的蛋白表达检测。其中，一抗憐酸化AMPK及AMPK抗体(Cell Signalling公司）稀 释浓度为1:1000,一抗葡萄糖转运体蛋白1抗体(Abeam公司）稀释浓度为1:1000,一抗均于4 摄氏度解育过夜;二抗为辣根过氧化氨酶标记抗兔抗体(sigma公司），稀释浓度为1:2000， 室溫解育1小时。抗体解育结束漂洗后，利用辣根过氧化氨酶化学发光法，采用高灵敏度化 学发光成像仪显影(化emidoc，Bi〇-Rad公司），经过Image J软件分析图像获得数据。
[0113] (2)碳酸酢酶免疫组化染色(CA9)
[0114] 取出各组大鼠新鲜肺组织，浸泡在10%福尔马林溶液中过夜，然后换70%乙醇保 存，石蜡包埋切片，根据免疫组织化学染色基本方法进行碳酸酢酶肺组织切片染色。碳酸酢 酶一抗(Novus公司)稀释浓度为1:100，4摄氏度解育过夜;二抗为辣根过氧化氨酶标记抗兔 抗体（Sigma公司），稀释浓度为1:200,室溫解育1小时。抗体解育结束后，经辣根过氧化氨 酶-二氨基联苯胺显色，苏木精伊红染色后，酒精二甲苯脱水固定后封片。
[0115] 2、实验结果和结论
[0116] 蛋白印记实验结果发现:利拉鲁肤治疗组较肺高压组大鼠肺组织Glut-1表达有显 著减少，pAMPK/AMPK比例明显升高，提示AMPK憐酸化程度增高，AMPK通路被激活，且下游葡 萄糖转运蛋白表达下降。
[0117] 免疫组化实验结果发现:碳酸酢酶在利拉鲁肤治疗组有显著下降，提示利拉鲁肤 治疗后，AMPK通路下游缺氧诱导因子下调，组织缺氧程度减轻(图6，图7)。
[0118] W上实验结论表明，利拉鲁肤能够激活机体能量代谢核屯、通路AMPK，平衡肺血管 葡萄糖代谢，减轻细胞组织缺氧，从而改善肺高压肺血管重构病变，治疗肺动脉高压。
【主权项】
1. 胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备治疗肺动脉高压药物中的应用。2. 权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是减轻肺血管重构。3. 权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是抑制异常的细胞增生。4. 权利要求3所述的应用，所述抑制异常的细胞增生是抑制肺血管平滑肌细胞增生。5. 权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是降低细胞糖酵解水平。6. 权利要求1所述的应用，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂，是具有对肺动脉细胞糖 代谢进行调节功能的胰高血糖素样肽-1受体激动剂。7. 权利要求6所述的应用，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂选自艾塞那肽 (exenatide)、利拉鲁肽（liraglutide)、利西拉来（lixisenatide)，阿必鲁肽 (albiglutide)，或杜拉鲁肽（dulaglutide)。8. -种治疗肺动脉高压的药物，其特征是，其活性成分是胰高血糖素样肽-1受体激动 剂。9. 权利要求8所述的药物，所述治疗肺动脉高压，是抑制肺血管平滑肌细胞增生并减轻 肺血管重构。10. 权利要求8所述的药物，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂选自艾塞那肽 (exenatide)、利拉鲁肽（liraglutide)、利西拉来（lixisenatide)，阿必鲁肽 (albiglutide)，或杜拉鲁肽（dulaglutide)。
【文档编号】A61P9/12GK105999272SQ201610526144
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】汪蕾, 方纬
【申请人】汪蕾, 方纬