一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节疼痛和局部注射动物模型的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节疼痛和 局部注射动物模型的构建方法，属于医学动物模型研究领域。
【背景技术】
[0002] 四肢关节炎症疼痛是临床常见症状，病因复杂，几乎覆盖全年龄段各类人群，在退 变性骨关节疾病高发的中老年患者群体中发病率高，可导致严重运动功能障碍，是导致老 年致残、失去自主生活能力的重要原因。目前临床无特效治疗手段，对疼痛严重患者需行人 工关节置换手术治疗，费用高且损伤大，术中术后危及生命的并发症多。但是，患者如疼痛 控制良好，则一般不需手术治疗。因此，开发适合长期应用的关节疼痛镇痛方案，是骨关节 外科临床重点研究方向。现今临床上主要应用的镇痛方法为口服非酱体类抗炎药或阿片类 药物。其中非酱体类抗炎药长期应用后患者不良反应发生率高，包括危及生命的并发症如 严重胃肠道溃瘍、屯、血管疾病、凝血功能障碍等。口服阿片类药物虽然相对安全，但患者严 重恶屯、、呕吐及便秘发生率高，一般无法耐受。
[0003] 近年临床研究发现，吗啡等阿片类药物局部注射可能提供良好的关节镇痛作用 (参见文献：Garcia JB, Barbosa Neto J0, Vasconcelos JW, et al. Analgesic effic曰cy of the intr曰-曰rticul曰r 曰dministr曰tion of high doses of morphine in patients undergoing total knee arthroplasty. Rev Bras Anestesiol. 2010:60(1): 1-12.)，局部注射可减少全身不良反应，能够避免口服或注射非酱体类药物可能导致的消 化系统和屯、血管系统并发症，适合反复长期应用。局部麻醉药物或激素类药物外周注射镇 痛效果亦较好，但与阿片类药物相比，局部麻醉药物和激素类药物存在明显的软骨细胞毒 性及肌肉骨骼干细胞毒性问题，并不适合反复或长期应用（参见文献:Gungor I，Yilmaz A, Ozturk AM, et 曰1. Bupiv曰c曰ine and levobupiv曰c曰ine induce apoptosis in rat chondrocyte cell cultures at ultra-low doses. Eur J Orthop Surg Traumatol. 2014; 24(3) :291-295.)。阿片类药物外周注射给药有效且安全性高（参见文献： Ficklscherer A, Kreuz PC, Sievers B, et al. Fentanyl is less toxic on adult human mesenchymal stem cells compared to ropivacaine when used intraarticularly. A controlled in vitro study. Connect Tissue Res. 2013;54 (6) :403-407.),但是，经关节周围局部注射的阿片类药物，体内发挥作用机制不同于口服 或静脉等全身给药方式，全身给药时主要通过激活中枢神经系统内阿片类受体产生镇痛作 用。由于关节周围存在大量的外周阿片类受体，局部注射阿片类药物后，其产生镇痛作用的 途径将发生变化。因此，经关节周围局部注射的阿片类药物，通过何种机制发挥镇痛作用、 如何决定最佳注射剂量、药物配伍和应用频次，尚缺少深入有效的基础研究，尚未建立起专 用的在体动物模型进行全面科学的临床前研究。
[0004] 单舰醋酸钢生理盐水注射液可用于建立大鼠等膝关节骨性关节炎动物模型，可良 好的模拟临床骨性关节炎症状和病理表现(参见文献:Kim JK, Kim ΤΗ, Park SW, et al. Protective effects of human pi曰cent曰 extract on cartilage degradation in experimental osteoarthritis. Biol Pharm Bull. 2010;33(6):1004-10.)。但在造模过 程中因实验动物小，膝关节给药困难，实际应用的失败率较高。本发明改进传统注射部位， 选择踩关节注射，使注射操作简便易行，同时保证在动物模型中良好复制临床关节炎症的 疼痛症状，尚未有相关报道。此外，本发明所选择关节周围镇痛药物注射部位给药方便，重 复性良好，尚无报道上述实验技术在阿片类药物外周镇痛作用机制研究中的应用。
[0005] 综上，建立起真实反应临床上阿片类药物关节周围注射治疗关节炎症疼痛的在体 动物模型，对深入研究阿片类药物在关节炎症疼痛治疗中的作用机制有重要意义，将加快 研究进程，明确阿片类药物局部应用在临床上发挥关节镇痛作用的潜在机制及镇痛疗效。 本发明制备的关节炎症疼痛模型简便易行，重复性及稳定性良好，为临床开发适合长期应 用且无严重不良反应的关节镇痛治疗方法提供条件。随着相关技术的不断更新和发展，研 究者对阿片类药物局部应用的认识和理解将愈加深入和透彻，将更好改进当前用药方案， 造福患者和社会。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种简便易行、对技术设备要求低而制备成功率高、能够 真实模拟临床阿片类药物局部注射后治疗关节炎症疼痛情况的动物模型的构建方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机 制的大鼠关节疼痛和局部注射动物模型的构建方法，包括:（1)单舰醋酸钢踩关节注射诱导 实验动物关节炎症疼痛症状;（2)实验动物关节周围阿片类药物注射。
[0008] 其中，步骤（1)中，采用雄性大鼠，体重质量200 ±20克，麻醉，取单舰醋酸钢生理盐 水溶液，在实验组和对照组大鼠后足垫部向踩关节方向注射，剂量为60化/只，即可制备大 鼠关节疼痛模型。
[0009] 所述单舰醋酸钢生理盐水溶液中，单舰醋酸钢浓度为60mg/mL，每1ml生理盐水溶 液中含单舰醋酸钢60mg，经足后垫行踩关节腔内注射，用于诱导大鼠关节疼痛症状。
[0010] 所述雄性大鼠为雄性Wistar大鼠或Sprague-Dawley大鼠。
[0011] 步骤(2)中，实验组关节周围注射的药物为盐酸吗啡注射液巧mg/kg)，或盐酸曲马 多注射液，或其它注射用阿片类药物注射液，对照组关节周围注射安慰剂为与实验组等体 积生理盐水。
[001引注射部位为大鼠膝关节后外侧，用惜小头下方约5mm处，局部解剖位置在腔，脾骨 间隙中，深度应达肌筋膜层。
[0013] 对如上注射了阿片类药物的动物疼痛症状行为学、血清学及分子生物学相关指标 进行检测。
[0014] 在动物模型制备成功后4小时，完成行为学评估和痛阔测量后，对实验组和对照组 动物作静脉采血后处死，对动物血清学相关炎症指标进行鉴定。
[0015] 行为学评估内容：单舰醋酸钢生理盐水溶液注射后24小时，定性观察大鼠是否出 现Ξ足贩行和踩关节红肿症状，确定关节炎症疼痛模型造模成功。确定造模成功后，行实验 组盐酸吗啡注射液和对照组生理盐水注射。注射后4小时开始，定量记录大鼠30分钟内祿咬 右后足次数并行统计分析。
[0016] 痛阔测量:单舰醋酸钢生理盐水溶液注射后，W及阿片类药物与生理盐水注射后， 分别W福射热灯照射测量痛阔。测试中于室溫下将大鼠置于热福射仪专用容器内，静置15 分钟后，W强光照射踩关节模拟热损伤，W大鼠的缩爪反射潜伏期为观察指标，W左右两侧 踩关节的潜伏期差值为痛敏分数，每间隔10分钟测定一次，取3次测定平均值作为测定结 果，评估实验组和对照组动物测量结果是否存在统计学差异。
[0017] 生物化学检测项目包括但不仅限于血清炎症因子白介素1-UIL-1)和肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)，亦可进行基因及蛋白表达水平检测。选择的疼痛相关炎症因子在关节炎症疼 痛的病理过程中浓度增加，阿片类药物产生良好镇痛作用同时可伴随炎症因子检测值的下 降。
[0018] 采用本发明的方法，通过在大鼠踩关节注射单舰醋酸钢生理盐水溶液诱导关节疼 痛后，进行关节周围阿片类药物吗啡局部注射发挥镇痛作用，建立了一种用于研究阿片类 药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节疼痛和局部注射动物模型，有效模拟了临床上外周 局部应用阿片类药物后产生关节疼痛镇痛疗效的真实情况，发现采用本发明方法获得的动 物模型符合临床实际且稳定性高，从而为进一步了解阿片类药物关节周围局部注射对关节 炎症疼痛的镇痛机制，W及探究和改进临床用药方案提供了动物模型。同时，该方法操作简 易，技术设备要求低，成功率高。
【附图说明】
[0019] 图1为动物模型构建和镇