痛机制研究流程示意图。
[0020] 图2为经大鼠足底垫行踩关节注射部位示意图。
[0021] 图3为用于大鼠关节周围注射阿片类药物或生理盐水对照的解剖部位示意图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1: 1. Wistar大鼠踩关节疼痛模型的制备:WiS化r雄性大鼠20只，体重(200 ± 20)克，随机 分为实验组（10只）和对照组（10只）。正式实验开始第1天时，两组实验动物均采用10 %水合 氯醒(300mg/kg)腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，取左侧邸位，70%酒精将右侧足底及外踩 区域消毒。采用单舰醋酸钢生理盐水溶液(每1ml含单舰醋酸钢60mg)。在实验组和对照组大 鼠后足垫部位进针穿刺、向踩关节方向注入单舰醋酸钢生理盐水溶液，剂量60化/只。实验 后24小时，观察动物出现活动减少、Ξ足贩行，右踩关节红肿，提示关节疼痛模型制备成功， 随后采用福射热测痛仪测量大鼠注射侧肢体痛阔，福射热溫度设置为42°C，加热上限20秒 W避免热损伤。测试部位为右后肢足垫中央皮肤，测试指标为福射热照射开始至大鼠出现 缩腿反应的潜伏期并记录，共测3次，每次间隔5min。
[0023] 2.实验动物关节周围阿片类药物注射:前述关节疼痛模型制备成功后，再次W前 述方法麻醉动物，并W70%酒精消毒将膝关节W下区域消毒，进行关节周围药物注射。注射 部位为大鼠膝关节后外侧，脾骨小头下方约5mm处，局部解剖位置在腔、脾骨间隙中，深度应 达肌筋膜层。实验组关节周围注射的药物为盐酸吗啡注射液(5mg/kg);对照组关节周围注 射安慰剂为与实验组等体积生理盐水。
[0024] 实施例2:鉴定动物疼痛症状行为学、痛阔测量和生化检测相关指标： 实验组于关节周围局部药物注射、及对照组行生理盐水注射后4小时，记录30分钟内大 鼠祿咬右后肢次数，记录后，再次采用福射热测痛仪测量大鼠注射侧肢体痛阔，福射热溫度 设置为42°C，加热上限20秒W避免热损伤。测试部位为右后肢足垫中央皮肤，测试指标为 福射热照射开始至大鼠出现缩腿反应的潜伏期并记录，共测3次，每次间隔5min，两次痛 阔测量结果均取平均值，数据采用平均数±标准差(x±S)表示，进行方差分析。
[0025] 痛阔测量结束后，断头处死大鼠，5mL离屯、管收集全血，3000转4度离屯、10分钟后， 取上清后分别置于1.5mL容积EP管中，置于冰上保存，采用化ISA法进行检测血清白介素1-1 (化-1)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)水平，结果取平均值，数据采用平均数±标准差(i±s) 表示，进行方差分析。
[0026] 评价结果:实验组大鼠痛阔测量结果为6.71 ± 0.78s，对照结果为4.13 ± 0.36s，提 示吗啡局部注射显著提高实验组大鼠热福射痛阔检测水平(P<〇.01)。与对照组大鼠相比， 实验组接受阿片类药物局部注射的大鼠血清白介素1-UIL-1)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a) 水平检测结果提示：比-1含量实验组109.623±7.327pg/ml，对照组138.413±9.545pg/ml， 实验组较对照组含量显著降低(P<〇. 01) ; TNF-a含量实验组0.811±0.06化g/ml，对照组为 1.419±0.06化g/ml，实验组较对照组含量显著降低(P<0.01)。
[0027] 分子生物学 表1.实验组和对照组大鼠祿足次数(态±s，次AOmin)
注:*与实验组比较，P<0.01。
[002引 表2.实验组和对照组大鼠不同时间痛阔变化比较(i：±s，s)
注:*与实验组比较，P<0.01。
[0029] 表3.实验组和对照组大鼠血清白介素1和肿瘤坏死因子-α比较(玄±s)
注:*与实验组比较，p<0.01。
[0030]基于本发明动物模型的阿片类药物镇痛作用机制初步评估:实验结果表明，局部 注射阿片类药物可W通过调节疼痛相关炎症因子水平发挥镇痛作用，可减少血清中白介素 1-1(比-1)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)水平，由于两种炎症因子在体内作用具有多层次多祀 点的复杂特点，可进一步利用本动物模型对更其明确作用机制、如基因和蛋白表达调控及 细胞信号转导途径进行深入研究。
【主权项】
1. 一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节疼痛和局部注射动物 模型，其特征在于，通过如下方法构建： (1) 单碘醋酸钠踝关节注射诱导实验动物关节炎症疼痛症状； (2) 实验动物关节周围阿片类药物注射。2. 根据权利要求1所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节 疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:步骤(1)中踝关节注射药物诱导实验动物关节炎症 疼痛症状的方法为:采用雄性大鼠，体重质量200 ± 20克，取单碘醋酸钠生理盐水溶液，在实 验组和对照组大鼠后足垫部向踝关节方向注射，剂量为60μ!7只。3. 根据权利要求1或2所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠 关节疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:所述的单碘醋酸钠生理盐水溶液浓度为60mg/ mL〇4. 根据权利要求1-3任何一项所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制 的大鼠关节疼痛和局部注射动物模型，其特征在于，所述动物为雄性Wistar大鼠或 Sprague-Dawley大鼠。5. 根据权利要求1-4任何一项所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制 的大鼠关节疼痛和局部注射动物模型，其特征在于，所述实验动物分组包括但不仅限于实 验组(阿片类药物注射)和对照组(生理盐水注射），可根据具体研究要求增加设置空白对照 组及其它干预措施组等。6. 根据权利要求1所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节 疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:步骤(2)中关节周围注射药物中，实验组动物接受 注射的药物为盐酸吗啡注射液，或盐酸曲马多注射液，或其它注射用阿片类药物注射液，对 照组动物接受注射的药物是与实验组药物等体积的生理盐水。7. 根据权利要求5所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节 疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:实验组和对照组关节周围注射部位均为大鼠膝关 节后外侧，腓骨小头下方约5mm处，局部解剖位置在胫、腓骨间隙中，深度应达肌筋膜层。8. 根据权利要求1所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节 疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:关节炎症疼痛模型建立成功24小时后，实验组和对 照组分别行阿片类药物和安慰剂关节周围注射，注射后4小时，两次注射后均以辐射热灯照 射测量痛阈，实验组和对照组动物测量结果存在统计学差异时，关节炎症疼痛动物的阿片 类局部注射镇痛作用动物模型制备成功。9. 根据权利要求1所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关节 疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:步骤(2)的动物单碘醋酸钠生理盐水溶液注射后24 小时，作实验动物关节疼痛相关行为学评估，并以辐射热灯照射测量痛阈，对动物进行疼痛 行为学、痛阈测量及生物化学相关指标检测。10. 根据权利要求1所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关 节疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:在动物关节周围药物注射后4小时，完成行为学 评估和痛阈测量，对实验组和对照组动物作静脉采血后处死，对动物血清学和分子生物学 相关指标进彳丁鉴定。11. 根据权利要求10所述的一种用于研究阿片类药物外周给药镇痛作用机制的大鼠关 节疼痛和局部注射动物模型，其特征在于:所述生物化学分析包括但不仅限于血清学生化 检测项目包括但不仅限于炎症因子白介素 l-l(IL-l)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)等疼痛相 关炎症因子，亦可进行基因及蛋白表达水平检测。
【专利摘要】本发明提供一种研究阿片类药物经关节周围局部注射后发挥镇痛作用机制的动物模型构建方法。本发明采用单碘醋酸钠诱导大鼠踝关节疼痛症状，联合关节周围阿片类药物给药技术，可对阿片类药物局部注射的镇痛作用机制进行动物疼痛行为学和分子生物学层面的深入研究。本发明动物模型的建立，将为阿片类药物对关节炎症疼痛治疗作用的课题研究，尤其是探究局部用药对关节炎症的抗炎镇痛作用机制，提供一种有效的研究手段。该技术基于与人类关节炎症疼痛高度近似的大鼠关节炎症疼痛模型和与临床关节周围注射镇痛方式高度近似的给药方式，进行全面的疼痛相关行为学评估、痛阈变化测量及生物化学分析。该模型构建方法简便易行，设备技术要求低，成功率高。
【IPC分类】A01K67/02, A61K31/19
【公开号】CN105594660
【申请号】CN201610027348
【发明人】张淼, 张旭然
【申请人】张淼, 张旭然
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月15日