作为glp1/胰高血糖素双重激动剂的毒蜥外泌肽-4衍生物的制作方法
【专利说明】作为GLP1 /胰高血糖素双重激动剂的毒蜥外泌肽-4衍生物 发明领域
[0001] 本发明涉及毒蜥外泌肽_4 (exendin-4)肽类似物，其与纯GLP-I激动剂毒蜥外泌 肽-4相反，激活GLPl和胰高血糖素受体两者，以及涉及它们的医学用途，例如在治疗代谢 综合征病症（包括糖尿病和肥胖症）中的用途，以及用于减少过度食物摄入。
[0002] 发明背景
[0003] 毒蜥外泌肽_4是39个氨基酸的肽，其由钝尾毒蜥（Heloderma suspectum)的唾 液腺产生（Eng, J. et al.，J. Biol. Chem.，267:7402-05, 1992)。毒蜥外泌肽-4 是胰高血糖 素样肽-I (GLP-I)受体的激活剂，然而其并不显著激活胰高血糖素受体。
[0004] 毒蜥外泌肽-4具有许多用GLP-I观察到的糖调节（glucoregulatory)作用。临床 和非临床研宄已经显示毒蜥外泌肽-4具有若干有益的抗糖尿病特性，包括胰岛素合成和 分泌的葡萄糖依赖性增强、对胰高血糖素分泌的葡萄糖依赖性抑制、减慢胃排空、减少食物 摄入和体重以及0细胞群和0细胞功能标志物的增加（Gentilella R et al.，Diabetes Obes Metab.，11:544_56,2009 ;Norris SL et al.，Diabet Med.，26:837_46,2009 ;Bunck MC et al.，Diabetes Care.，34:2041-7, 2011)。
[0005] 这些效应不仅对于糖尿病而且对于患肥胖症的患者都是有益的。患有肥胖症的患 者具有患上糖尿病、高血压、高血脂症、心血管疾病和肌骨骼疾病的更高风险。
[0006]相对于GLP-1，毒蜥外泌肽-4对于二肽基肽酶-4 (DPP4)的切割具有抗性， 导致更长的半衰期和体内作用持续时间（Eng J.，Diabetes，45(Suppl 2):152A(摘要 554)， 1996)。
[0007] 然而，由于在第14位的甲硫氨酸氧化（1^找1'0￥6〇116七31.，1^111. Pept.，141:113-9, 2007)以及第28位天冬酰胺的脱酰胺作用和异构化作用（W0 2004/035623)，毒蜥外泌肽-4是化学不稳定的。
[0008] 毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 1
[0009]hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps-nh2
[0010] GLP-I (7-36)-酰胺的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2
[0011] HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-NH 2
[0012] 利拉鲁肽（Liraglutide)是推向市场的化学修饰的GLP-I类似物，其 中除其它修饰外，第20位的赖氨酸与脂肪酸连接，导致延长的作用持续时 间（Drucker DJ et al.，Nature Drug Disc. Rev. 9, 267-268, 2010 ;Buse，J.B.et al.，Lancet, 374:39-47, 2009)。
[0013] 利拉鲁肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 195。
[0014] HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-) EFIAffLVRGRG-OH
[0015] 胰高血糖素是29个氨基酸的肽，当循环葡萄糖低的时候其被释放至血流中。胰高 血糖素的氨基酸序列示于SEQ ID N0:3。
[0016] HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQffLMNT-OH
[0017] 在低血糖症期间，当血液葡萄糖水平跌至低于正常，胰高血糖素给肝脏信号以降 解糖原并释放葡萄糖，导致血液葡萄糖水平增加达到正常水平。低血糖症是用胰岛素治 疗的患者的常见副作用，所述患者具有由于糖尿病导致的高血糖症（升高的血液葡萄糖水 平）。因此，胰高血糖素在葡萄糖调节中的最主要的作用是抵消胰岛素作用并维持血液葡萄 糖水平。
[0018] Holst (Holst, J. J. Physiol. Rev. 2007, 87, 1409)和 Meier (Meier, J. J. Nat. Rev. Endocrinol. 2012, 8, 728)描述了 GLP-I受体激动剂，例如GLP-1、利拉鲁肽和毒蜥外泌 肽-4,具有3种主要的药理学活性，通过减少空腹和餐后葡萄糖（FPG和PPG)来改善具有 T2DM的患者中的血糖控制：（i)增加葡萄糖依赖的胰岛素分泌（改善的第一和第二期）， (ii)在血糖过多情况下的胰高血糖素抑制活性，（iii)延迟胃排空速率，导致饮食来源葡 萄糖的迟缓吸收。
[0019] Pocai 等（Obesity 2012 ;20:1566 - 1571 ;Diabetes 2009,58,2258)和 Day 等 (Nat Chem Biol 2009 ;5:749)描述GLP-I受体和胰高血糖素受体的双重激活，例如通过 在一个分子内组合GLP-I和胰高血糖素的作用，产生具有抗糖尿病作用和显著的体重降低 效应的治疗原理。
[0020] 结合并激活胰高血糖素和GLP-I受体两者（Hjort et al.，Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124, 1994 ；Day Jff et al., Nature Chem Biol, 5:749-757, 2009)并抑制体重增长和减少食物摄入的肽描述于专利申请WO 2008/071972, WO 2008/101017, WO 2009/155258, WO 2010/096052, WO 2010/096142, WO 2011/075393, WO 2008/152403, WO 2010/07025U WO 2010/070252, WO 2010/070253, WO 2010/070255、WO 2011/160630、WO 2011/006497、WO 2011/152181、WO 2011/152182、WO 2011/117415、TO 2011/117416和TO 2006/134340中，其内容通过引用并入本文。
[0021] 此外，不仅仅激活GLP-I和胰高血糖素受体而且还激活GIP受体的三重共激动剂 肽描述于 WO 2012/088116 和 VA Gault 等（Biochem Pharmacol, 85, 16655-16662,2013 ;Di abetologia，56, 1417-1424, 2013)。
[0022] Bloom等（W0 2006/134340)公开了结合并激活胰高血糖素和GLP-I受体两者的肽 可以被构建为来自胰高血糖素和毒蜥外泌肽-4的杂合分子，其中N-端部分（如残基1-14 或1-24)源自胰高血糖素而C-端部分（如残基15-39或25-39)源自毒蜥外泌肽-4。
[0023] DE Otzen 等（Biochemistry, 45, 14503-14512, 2006)公开了 N-端和 C-端疏水 补丁（hydrophobic patch)参与胰高血糖素的纤维原化（fibrillation)，由于相关残基 (underlying residue)的疏水性和/或高(6-折叠倾向。
[0024] Krstenansky 等（Biochemistry, 25, 3833-3839, 1986)显不膜高血糖素残基 10-13 对于其受体相互作用和腺苷酸环化酶激活的重要作用。在本发明所描述的毒蜥外泌肽-4 衍生物中，相关残基中的若干个不同于胰高血糖素。尤其是残基TyrlO和Tyrl3,其已知参 与胰高血糖素的纤维化（DE Otzen, Biochemistry, 45, 14503-14512, 2006)，在第 10 位被 Leu置换而在第13位被非芳香族极性氨基酸Gln置换，导致具有可能改善的生物物理学特 性的毒蜥外泌肽-4衍生物。
[0025] 此外，本发明的化合物是在第14位具有脂肪酸酰化残基的毒蜥外泌肽-4衍生物。 在第14位的该脂肪酸官能化导致毒蜥外泌肽-4衍生物，其与相应的非酰化毒蜥外泌肽-4 衍生物相比，不仅对GLP-I受体而且对胰高血糖素受体都具有高活性。此外，该修饰导致改 善的药物动力学谱。
[0026] 本发明的化合物对中性肽链内切酶（NEP)和二肽基肽酶-4 (DPP4)的切割更具抗 性，导致与GLP-I和胰高血糖素相比更长的半衰期和体内作用持续时间。此外，所述化合物 对其它蛋白酶包括组织蛋白酶D是稳定的。
[0027] 本发明的化合物优选地不仅在中性pH而且在pH4. 5也可溶。该特性可允许和胰 岛素或胰岛素衍生物以及优选地和基础胰岛素如甘精胰岛素/ LantusR共配制用于组合疗 法。
[0028] 发明概述
[0029] 本文提供的是毒蜥外泌肽_4衍生物，其有效激活GLPl和胰高血糖素受体。在这 些毒蜥外泌肽-4衍生物中，除其它取代外，第14位的甲硫氨酸被侧链携带-册1 2基团的氨 基酸置换，其进一步被非极性残基取代（如任选地和接头组合的脂肪酸）。
[0030] 本发明提供了具有式（I)的肽化合物：
[0031] R1-Z-R2 (I)
[0032] 其中Z是具有式（II)的肽部分
[0033] His-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-X15-X16-X17-X 18-Ala-X20-X21-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-X28-X29-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-X35-Pr〇-Pr〇-Pr〇-X39-X40 (II)
[0034] X2表示选自Ser、D-Ser和Aib的氨基酸残基，
[0035] X3表示选自GlruHis和a -氨基-官能化的Gln的氨基酸残基，其中Gln的官能 化可以是a -NH2基团的H由（C「C4)-烷基取代，
[0036] X14表示侧链具有-NH2基团的氨基酸残基，其中所述-NH 2侧链基团 由-C (0) -R5、-C (0) O-R5、-C (0) NH-R5、-S (0) 2-R5或 R 5官能化，优选由-C (0) -R 5官能化，其中 R5可以是包括多达50个或多达100个碳原子以及任选地选自卤素、N、0、S和/或P的杂原 子的部分，
[0037] X15表示选自Glu和Asp的氨基酸残基，
[0038] X16表示选自Ser、Glu和Lys的氨基酸残基，
[0039] X17表示选自Arg、Glu、Gln、Leu、Aib和Lys的氨基酸残基，
[0040] X18表示选自Arg、Ala和Lys的氨基酸残基
[0041] X20表示选自Gln、Arg、Lys、His、Glu和Aib的氨基酸残基，
[0042] X21表示选自Asp、Leu和Glu的氨基酸残基，
[0043] X28 表示选自 Asn、Arg、Lys、Aib、Ser、Glu、Ala 和 Asp 的氨基酸残基，
[0044] X29表示选自Gly、Ala、D-Ala和Thr的氨基酸残基，
[0045] X35表示选自Ala、Glu、Arg和Lys的氨基酸残基，
[0046] X39表示Ser或不存在，和
[0047] X40不存在或表示侧链具有-NH2基团的氨基酸残基，其中所述-NH 2侧链基团任选 地由-C (0) -R5、-C (0) O-R5、-C (0) NH-R5、-S (0) 2-R5或 R 5官能化，优选由-C (0) -R 5官能化，其 中R5可以是包括多达50个或多达100个碳原子以及任选地选自卤素、N、0、S和/或P的 杂原子的部分，
[0048] R1表示所述肽化合物的N-端基团并且选自NH2和单或双官能化NH2，
[0049] R2表示所述肽化合物的C-端基团并且选自
[005