-ATPase的抑制剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药丹参作用祀点的发现与拓宽临床应用范围，具体地说是丹参中酪 酸类化合物的新作用祀点的发现及此类化合物在临床上的新应用，所述酪酸类化合物包括 原儿茶醒、丹参素、咖啡酸、紫草酸、丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、丹酪酸D等类结构化合物 及其衍生物、和它们药学上可接受的成盐化合物；所述祀点为GPR35和化 2^-ATPase ;所述临 床新应用为必力衰竭、高血压、冠状动脉性必脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等 疾病的预防和治疗。
【背景技术】
[0002] 丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根 茎，首载于《神农本草经》，具有巧癒止痛、养血安神、益气止烦等功效，其有效成分是脂溶 性的二聰类化合物和水溶性的酪酸类化合物。其中酪酸类化合物具有很强的抗过氧化、 清除自由基、抗必肌缺血缺氧的作用，在临床上主要用来治疗冠必病、脑血栓、必肌梗死等 必血管疾病。长期的临床应用及此类化合物在治疗疾病表现出的明显效果，使此类化合 物作用机制的研究备受关注，目前研究比较集中于粗提物或较简单的化合物的药理作用 的研究，但关于此类化合物的作用祀点研究甚少化.M. Zhou, Z. Zuo, M. S. S. Chow, Journal of Clinical Pharmacology 45 (2005) 1345-1359 ;高秀梅，张伯礼，商洪才，王怡，郭 利平，张萌，史红，刘密新，中国临床康复7 (2003) 1754-1756 ;赵娜，郭治昕，赵雪，赵利 斌，国外医药：植物药分册22(2007) 155-160;赵淑娟，章国琪，刘涂，胡之璧，中草药 35 (2004) 341-344 ;付辛芳，刘晓红，中国药业 15 (2006) 76-77.)。
[0003] GPR35受体是一类包含309个氨基酸的孤儿受体，于2004年在胃癌细胞中发现 此受体，研究表明其在调控NIH-3T3细胞的转录过程中起作用。GPR35在膜腺、小肠、结 肠、脾和免疫细胞中表达相对比较高，在一些人体癌细胞如HT-29细胞中也有表达。犬 尿哇晰酸、2-醜基溶血磯脂酸、敏喘宁、帕莫酸、色甘酸钢、木犀草素、搬皮素、尼氣酸等 化合物都是GPR35的激动剂，目前的研究表明GPR35受体与必力衰竭、高血压、冠状动 脉性必脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，GPR35的新配体的发现 和确认对于阐明GPR35的生物学和药理学功能有重要的意义，送将为化合物的新临床 应用提供导向（A. M曰cKenzie, J. L曰ppin, D. T曰ylor, S.化cklin, G. Milli邑曰n, Frontiers in endocrinology (2011) 1-10 ;H. Y. Deng, H. B. Hu, Y. Fang, Febs Letters 585 (2011) 1957-1962 ;H. Y. Deng, H. B. Hu, Y. Fang, Scientific Reports (2012) 1-12 ; H.Y.Deng,Y.Fang, Pharmacology89(2012)211-219 ;H.Deng, Y. Fang, Pharmaceuticals 6(2013)500-509.) 〇
[0004] 目前关于丹参中酪酸类化合物作用于GPR35受体及丹酪酸A与丹酪酸C的双革己点 作用尚未报道。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及丹参中酪酸类化合物的新作用祀点的发现及此类化合物在临床上的 新应用，目的之一是提供丹酪酸类化合物中丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹参素 的新作用祀点GPR35 ;目的之二是提供此类化合物中丹酪酸A和丹酪酸C的双祀点GPR35和 Ca2+-ATPase。目的之H是提供此类化合物在临床上的新应用范围。丹酪酸A、丹酪酸B、丹 酪酸C、紫草酸及丹参素的化学结构如下：
[0007] 体外细胞实验表明，本发明中的丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹参素作 用于GPR35雙体（属于G蛋白偶联雙体（GPCR)),此雙体与必力巧竭、局血压、殖状动脉性必 脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据祀点与疾病的关联关系，可拓宽 送些化合物的临床应用范围；丹酪酸A和丹酪酸C呈现双祀点作用，为临床应用提供作用机 制的解释和为拓宽临床应用提供导向。
【附图说明】
[000引图1 A-丹参中酪酸类化合物在HT-29细胞上的DMR响应信号；B-经丹参中酪酸 类化合物预处理Ih后，1 U M敏喘宁在HT-29细胞上的DMR响应信号；C-经丹参中酪酸类化 合物预处理比后，16 U M己醜胆碱在HT-29细胞上的DMR响应信号；
[0009] 图2 A-丹参中酪酸类化合物在A431细胞上的DMR响应信号；B-经丹参中酪酸类 化合物预处理Ih后，16nM缓激肤在A431细胞上的DMR响应信号；C-经丹参中酪酸类化合 物预处理比后，1 U M组胺在A431细胞上的DMR响应信号；
[0010] 图3丹酪酸A、丹酪酸B、丹参酸C、紫草酸和丹参素在HT-29细胞上的剂量响应曲 线；
[0011] 图4经不同浓度丹酪酸A、丹酪酸B、丹参酸C、紫草酸和丹参素预处理比后，1 U M 敏喘宁在HT-29细胞上的剂量响应曲线；
[0012] 图5经不同浓度ML145预处理IOmin后，丹酪酸A、丹酪酸B、丹参酸C、紫草酸和丹 参素在HT-29细胞上的剂量响应曲线；
[0013] 图6丹酪酸A、丹酪酸C、毒胡萝h素和环匹阿尼酸在A431细胞上的剂量响应曲 线；
[0014] 图7经不同浓度的丹酪酸A、丹酪酸C、毒胡萝h素和环匹阿尼酸预处理比之后， 16 U M环匹阿尼酸在A431细胞上的剂量响应曲线。
【具体实施方式】
[0015] 现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限 定。
[0016] 实施例1 ;丹参中酪酸类化合物在HT-29细胞和A431细胞上的初步药理学表征
[0017] 材料丹酪酸D来源于大连工业大学朱靖国实验室，其余化合物购于上海源叶生物 科技有限公司；HT-29细胞和A431细胞购于中国科学院上海细胞库；敏喘宁、己醜胆碱、组 胺、缓激肤、毒胡萝h素和环匹阿尼酸购于Sigma公司。检测平台为康宁第H代Epic''成像 仪，检测的信号为细胞动态质量重置值MR)引起的波长位移。
[0018] 将处于对数生长期的HT-29细胞和A431细胞，分别接种于384孔的细胞板的不同 孔中，每孔的接种体积为40 U L每孔接种的细胞数目分别为3. 2 X IO4和2. 5 X IO4个，将接 种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20-2化，至细胞融合度达95%左右，HT-29细胞进行 活性实验，A431细胞需要继续饥饿24h再进行实验。首先监测丹参中酪酸类化合物（终浓 度为IOuM)作用于HT-29细胞和A431细胞的响应信号；然后使用敏喘宁（终浓度为IyM) 和己醜胆碱（终浓度为16 U M)处理HT-29细胞，使用缓激肤（终浓度为16nM)和组胺（终 浓度为IuM)处理A431细胞，监测待测化合物对探针分子作用于细胞的影响。
[0019] 将丹参中酪酸类化合物迷迭香酸（1)、紫草酸（2)、丹酪酸A(3)、丹酪酸B(4)、丹酪 酸"5)、丹酪酸0化）、丹参素（7)、咖啡酸（8)、异阿魏酸巧）、鼠尾草酪（10)、原儿茶醒（11) 和熊果酸（12) W 10 U M的终浓度作用于HT-29细胞（图1)，从丹参中酪酸类化合物本身响 应信号图IA中，可W发现丹酪酸A与丹酪酸C表现出比较强的正DMR信号，并且丹酪酸C 的响应强度大于丹酪酸A的响应强度；迷迭香酸、紫草酸、丹酪酸B和丹参素的响应信号为 较弱的正信号；其他的丹参化合物没有明显的DMR信号。经丹参中酪酸类化合物对HT-29 细胞的预处理比后，加入浓度1 U M的敏喘宁继续监测比，结果如图IB所示，发现经丹酪酸 A和丹酪酸C预处理之后敏喘宁的响应信号大大降低，由于敏喘宁是GPR35的激动剂，可推 断丹酪酸A和丹酪酸C对GPR35有较强的激动作用；经紫草酸、丹酪酸B和丹参素预处理之 后，敏喘宁的响应信号也部分的降低，可推断紫草酸、丹酪酸B和丹参素对GPR35有较弱的 激动作用。经丹参中酪酸类化合物对HT-29细胞的预处理Ih后，加入浓度16 U M的己醜胆 碱继续监测比，结果如图IC所示，发现丹酪酸A和丹酪酸C对己醜胆碱的响应信号有微弱 的影响而其他化合物对己醜胆碱的响应信号没有影响。
[0020] 将丹参中酪酸类化合物W 10 U M的终浓度作用于A431细胞（图2)，从丹参中酪 酸类化合物本身响应信号图2A中，可W发现丹酪酸A与丹参酸C表现出比较强的正DMR信 号，并且丹酪酸C的响应强度大于丹酪酸A的响应强度；迷迭香酸、紫草酸、丹酪酸B和鼠尾 草酪的响应信号为较弱的正DMR信号；其他的丹参化合物没有明显的响应信号。经过丹参 中化合物对A431细胞的预处理比，分别加入16nM缓激肤和1 U M组胺，结果如图2B和2C 所示，发现丹酪酸A和丹酪酸C对缓激肤和组胺的响应信号都有一定的脱敏作用。
[0021] 实施例2 ;丹参中某些酪酸类化合物作用于GPR35受体的发现与验证
[0022] 通过比对图IA和1B，推断丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素的作用革己 点为GPR35受体，本次实验从激动、脱敏和枯抗H个角度去验证分析。
[0023] 首先是激动分析，将丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素作用于HT-