29 细胞，每个化合物的浓度梯度都为 250 U M，125 U M，62. 5 U M，31. 25 U M，15. 625 U M，7. 813 U M, 3. 9063 y M, I. 953 y M, 0. 977 y M, 0. 488 y M, 0. 244 y M, 0. 122 y M, 0. 0610 y M,结果如图 3 所示，丹酪酸A、丹参酸C和紫草酸的剂量响应曲线是单相"S"型，并且都达到饱和响应，对 应的 ECso 值分别为 37. 69 + 3. 77 U M、19. 36 + 1. 80 U M、37. 63 + 13. 83 U M。丹酪酸 A、丹参 酸C与紫草酸的作用效能（e巧cacy)的强弱顺序是丹酪酸C〉丹酪酸A〉紫草酸；作用潜能 (potency)强弱顺序是丹酪酸C〉丹酪酸A W紫草酸。丹酪酸B和丹参素在最高浓度500 U M 仍没有达到饱和响应。
[0024] 然后使用脱敏分析的方法验证丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素作 用于GPR35受体的特异性。HT-29细胞经丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素 预处理Ih之后，每个化合物的浓度梯度都为250 U M，125 U M，62. 5 U M，31. 25 U M，15. 625 U M, 7. 813 U M, 3. 9063 U M, 1. 953 U M, 0. 977 U M, 0. 488 U M, 0. 244 U M, 0. 122 U M, 0. 0610 U M，再加入IiiM的敏喘宁继续监测比，结果如图4所示，丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草 酸和丹参素对受体的脱敏都呈现剂量依赖性。而且丹酪酸A、丹酪酸C、紫草酸和丹参素能 在高浓度时将敏喘宁的DMR响应信号脱敏至最小，对应的ICw值分别为3. 48 + 0. 38 U M、 2. 70 + 0. 31 U M、109 + 23 U M、30. 42 + 2. 25 U M。
[0025] 最后使用枯抗分析方法验证丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素作用于 GPR35受体的特异性。HT-29细胞经GPR35受体的枯抗剂ML145预处理IOmin之后，ML145 的浓度梯度为 64 U M, 32 U M, 16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 U M, 0. 0 625 U M，0. 0313 U M，0. 0156 U M，0. 00781 U M，再加入浓度为ECso的紫草酸、丹参素、丹酪酸 B (分别是125 y M、100 y M和100 y M)与浓度为ECw、EC5e、EC2。的丹酪酸A (分别是125 y M、 35 U M和15 U M)和丹酪酸C(分别是IOOy M、20 UM和4uM)，结果如图5所示。高浓度的 ML145能够完全抑制紫草酸、丹参素和丹酪酸B的响应，其ICw值分别为0.47 + 0. 07 U M、 0. 25 ± 0. 02 U M和1. 48 ± 0. 22 U M ;ML145对ECs。浓度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR响应信 号几乎没有影响；对ECs。浓度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR响应信号有部分的抑制作用， 对ECw浓度的丹酪酸A和丹酪酸C的DMR响应信号呈现剂量依赖性抑制，对应的ICw分别 是0. 15 ± 0. 08 U M和0. 25 ± 0. 03 U M，但仍没有完全抑制丹酪酸A和丹酪酸C的DMR响应信 号，由此可见丹酪酸A和丹酪酸C在低浓度时激活GPR35的同时，也激活其他受体；在高浓 度时更表现出激活了另一个受体。
[0026] 通过激动分析、脱敏分析和枯抗分析H个实验表明GPR35受体是丹酪酸A、丹酪酸 B、丹酪酸C、紫草酸和丹参素的作用祀点，同时发现丹酪酸A和丹酪酸C在HT-29细胞上至 少有两个作用祀点。
[0027] 目前的研究表明GPR35受体与必力衰竭、高血压、冠状动脉性必脏病、代谢综合 症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，根据祀点与疾病的关联关系，可拓宽丹酪酸A、丹酪 酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹参素化合物的临床应用范围。
[002引实施例3 ;丹酪酸A和丹酪酸C的双祀点作用机制
[0029] 结合丹酪酸A与丹参酸C在HT-29细胞和A431细胞上的初步表征，经丹酪酸A 与丹酪酸C预处理细胞之后，己醜胆碱、缓激肤和组胺的DMR信号都存在一定的变化，由于 己醜胆碱受体、缓激肤受体和组胺受体都是G a q偶联受体，说明丹酪酸A和丹酪酸C的激 活通路可能与G a q相关。因为G a q通路激活时会产生巧流，当巧泉被激活时也会产生巧 流，送样G a q通路与巧泉存在异源脱敏的现象，所W推断丹酪酸A与丹参酸C可能作用于 Ca2+-ATPase。为了验证丹酪酸A和丹酪酸C作用于Ca2^-ATPase,使用丹酪酸A、丹酪酸C、 Ca2^-ATPase抑制剂毒胡萝h素和环匹阿尼酸作用于A431细胞，丹酪酸A和丹酪酸C的浓 度梯度为 250 U M, 125 U M, 62. 5 U M, 31. 25 U M, 15. 625 U M, 7. 813 U M, 3. 9063 U M, 1. 953 U M，0. 977 U M, 0.488 U M, 0.244 U M，0. 122 U M, 0.0610 U M,毒胡萝 h 素的浓度梯度为 32 U M ,16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 u M, 0. 0625 u M, 0. 03125 u M, 0.0 l 56 U M, 0. 007812 U M, 0. 00391 U M，环匹阿尼酸的浓度梯度为 64 U M, 32 U M, 16 U M, 8 U M, 4 U M, 2 U M, 1 U M, 0. 5 U M, 0. 25 U M, 0. 125 u M, 0. 0625 u M, 0. 03125 u M, 0. 0156 u M, 0. 00781 U M，结果如图6所示，响应曲线呈现剂量依赖性且为单相"S"型，其对应的ECw值分别是 122. 46 + 11. 75 U M、60. 75 + 3. Oly M、0. 29 + 0. 02 U M 和 2. 04 + 0. 09 U M。A431 细胞经丹酪 酸A和丹酪酸C浓度梯度预处理比后，浓度为16 U M的环匹阿尼酸在A431细胞上的DMR 响应受到抑制（图7)，且与丹酪酸A和丹酪酸C的浓度呈剂量依赖关系，其对应的ICw值 分别是71. 43 + 9. 53 U M和26. 06 + 1. 70 U M，由此说明丹酪酸A和丹酪酸C的另一个作用革己 点与巧泉相关。丹酪酸A和丹酪酸C的双祀点作用为临床应用提供作用机制的解释和为拓 宽此类化合物的临床应用提供一定的导向。
【主权项】
1. 丹参中GPR35受体激动剂，其特征在于：其以丹参素、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹 酚酸C、及丹参素衍生物、紫草酸衍生物、丹酚酸A衍生物、丹酚酸B衍生物、丹酚酸C衍生 物、和上述化合物药学上可接受的盐中的一种或二种以上为活性成份。2. 按照权利要求1所述的激动剂，其特征在于：其中还包括有药物学上可接受的载体 或赋形剂。3. 丹参中酚酸类化合物在制备预防和/或治疗代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症 中的一种或二种以上疾病的药物中的应用，其特征在于：所述酚酸类化合物为丹参素、紫草 酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C及其衍生物、和它们药学上可接受的盐中的一种或二种以 上。4. 丹参中P型ATPase酶中Ca2+_ATPase的抑制剂，其特征在于：其以丹酚酸A、丹酚酸 C、及丹酚酸A衍生物、丹酚酸C衍生物、和上述化合物药学上可接受的盐中的一种或二种以 上为活性成份。5. 按照权利要求4所述的抑制剂，其特征在于：其中还包括有药物学上可接受的载体 或赋形剂。6. 丹参中酚酸类化合物在制备肢端动脉痉挛症、偏头痛、梅尼埃尔氏病、闭塞性脉管炎 中的一种或二种以上疾病的药物中的应用，其特征在于：所述酚酸类化合物为丹酚酸A、丹 酚酸C及其衍生物、和它们药学上可接受的盐中的一种或二种以上。7. 丹参中酚酸类化合物在制备心力衰竭和高血压中的一种或二种疾病的药物中的应 用，其特征在于：所述酚酸类化合物为丹酚酸C及其衍生物、和药学上可接受的盐中的一种 或二种以上。
【专利摘要】本发明涉及中药丹参作用靶点的发现与临床应用范围的拓宽，具体地说是丹参中酚酸类化合物的新作用靶点的发现及此类化合物在临床上的新应用，所述酚酸类化合物包括原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D等类结构化合物及其衍生物、和它们药学上可接受的成盐化合物。体外细胞实验表明，本发明中的化合物作用于孤儿受体GPR35，目前研究表明孤儿受体GPR35与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据此可拓宽此类化合物的临床应用范围，此外还发现此类化合物具有双靶点的作用特点，为临床新应用提供一定导向作用。
【IPC分类】A61P9/14, A61P35/00, A61K36/537, A61P3/00, A61P9/04, A61P11/06, A61P9/12, A61P25/06, A61P9/00, A61P29/00
【公开号】CN105521016
【申请号】CN201410521294
【发明人】梁鑫淼, 王纪霞, 张秀莉, 魏来, 史丽颖, 侯滔
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月30日