一种检测猪尿中β-受体激动剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测猪尿中β-受体激动剂的方法，尤 其是涉及一种同时检测猪尿中26种β-受体激动剂的方法。
【背景技术】
[0002] β-受体激动剂（β-agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，包括特布他 林、沙丁胺醇、齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、羟苄羟麻黄碱、克伦赛罗、溴代克伦特罗、克 伦普罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、克伦特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、班布特 罗、马布特罗、苯氧丙酚胺、马喷特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、沙美特罗、克伦潘特罗、福莫特 罗、菲诺特罗、异丙肾上腺素等数十种，可分为含取代基的苯胺型（如克仑特罗）、苯酚型 (如沙丁胺醇）、苯二酚型（如特布他林）三大类。
[0003] 在饲料中添加β-受体激动剂给动物饲喂后具有营养再分配作用，在动物体内能 促进脂肪分解，增加蛋白质的合成，提高酮体的产生，从而增加瘦肉率。但是如果激动剂的 用量大、时间长，在动物体内的蓄积量就会比较大，尤其是内脏等部位。人食用了这些药物 残留的畜禽产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应，严重的 甚至可能危及生命。因此国际上很多国家先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国 政府也明令禁止其使用。
[0004] β-受体激动剂被动物体摄取后，会在体内发生代谢反应，其代谢产物部分可通过 尿液排出。因此通过检测动物的尿液中受体激动剂的含量，能够准确地了解饲养过程 中该类药物的使用情况。目前，国内的检测方法主要有试纸卡快速筛查法、酶联免疫法、液 相色谱法、气质联用法、液质联用法等。相关国家标准有《农业部1025号公告-11-2008猪 尿中β-受体激动剂多残留检测液相色谱-串联质谱法》、《农业部1031号公告-3-2008猪 肝和猪尿中β-受体激动剂残留检测气相色谱-质谱法》、《农业部1063号公告-3-2008动 物尿液中11种β-受体激动剂的检测液相色谱-串联质谱法》。
[0005] 然而现有检测方法大都存在如下通量较低、前处理步骤繁琐和成本高等缺陷。 β-受体激动剂包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等数十种，目前相关的国家标准以及 技术文献所规定和报道的检测方法所能够同时检测的β-受体激动剂种类约为5-15种，相 对而言通量较低。目前相关的国家标准以及技术文献所规定和报道的前处理方法中所应用 的净化方法多为混合型阳离子交换（MCX)固相萃取法和亲水亲脂平衡（HLB)固相萃取法， 该类方法的净化原理为吸附-解吸附作用，操作步骤繁琐，且需配置大量淋洗液及洗脱液。 此外，目前检测方法前处理方法中所应用的净化方法中使用的两类固相萃取柱价格较高， 在大量样品的净化过程中成本较高。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种检测猪尿中β-受 体激动剂的方法。本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法通量高、操作步骤简单，成 本低。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种检测猪尿中β-受体激动剂的方法，猪尿样品经含氨水的乙腈稀释，与无水 硫酸钠和氯化钠混匀后离心，取上清液用分散式固相萃取，高速离心分离沉淀，甲醇-〇. 1 % 甲酸水溶液溶解沉淀，微孔滤膜过滤，以液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
[0009]本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法利用分散式固相萃取，吸附杂质、 净化样品，而猪尿样品β-受体激动剂不被吸附，能够一次性检测包括特布他林、沙丁胺 醇、齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、羟苄羟麻黄碱、克伦赛罗、溴代克伦特罗、克伦普罗、氯 丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、克伦特罗、羟甲基克伦特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特 罗、苯氧丙酚胺、马喷特罗、喷布特罗、苯乙醇胺Α、沙美特罗、克伦潘特罗、福莫特罗、菲诺特 罗、异丙肾上腺素等26种β-受体激动剂，通量明显高于同类型的其他方法。
[0010] 其中，所述分散式固相为十八烷基硅烷和Ν-丙基乙二胺的混合物。优选的，所述 十八烷基硅烷和Ν-丙基乙二胺的质量比为1:2~3:1，更优选为1:1。
[0011] 在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按g/mL计， 所述分散式固相与上清液的质量体积比为1:20~1:25。在一些具体实施例中，所述分散式 固相与上清液的质量体积比为1:20~1:25。
[0012] 在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法中，所述含氨 水的乙腈中氨水的含量为4ν/ν%。
[0013] 优选的，所述含氨水的乙腈与猪尿样品的体积比为5:1。
[0014]在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按g/mL计， 所述无水硫酸钠与猪尿样品的质量体积比为2:1~6:1。即每毫升猪尿样品中加入2g-6g 无水硫酸钠。优选为，按g/mL计，所述无水硫酸钠与猪尿样品的质量体积比为4:1。即每毫 升猪尿样品中加入4g无水硫酸钠。
[0015] 在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法中，按g/mL计， 所述氯化钠与猪尿样品的质量体积比为1:2~2:1。即每毫升猪尿样品中加入0. 5g~2g 氯化钠。优选为，按g/mL计，所述氯化钠与猪尿样品的质量体积比为1:1。即每毫升猪尿样 品中加入lg氯化钠。
[0016]在一些实施方案中，本发明所述检测方法所述与无水硫酸钠和氯化钠混合具体为 祸旋震汤混勾后放入丨旦温振汤机振汤后超声。
[0017] 优选的，所述振荡时间为20min，所述超声时间为5min
[0018]在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法中，所述离心 为 4°C，8000rpm，离心 5min。
[0019]在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法中，所述高速 离心为 4°C，lOOOOrpm，离心lOmin。
[0020] 在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法在高速离心前 还包括涡旋的步骤。所述涡旋的时间为2min。
[0021] 在一些优选实施方案中，本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法在高速离 心后还包括氮吹的步骤。所述氮吹具体为45°C氮吹至干。
[0022] 本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法中高速离心分离的沉淀采用甲 醇-0. 1%甲酸水溶液溶解微孔滤膜过滤后用于液相色谱-串联质谱测定。所述甲醇-0. 1% 甲酸水溶液为甲醇与0. 1 %甲酸水溶液的混合溶液。优选的，所述甲醇与0. 1 %甲酸水溶液 的体积比为1:9。
[0023] 在一些实施方案中，本发明所述检测猪尿中受体激动剂的方法中，所述微孔 滤膜孔径为〇. 22μm。
[0024] 本发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法采用液相色谱-串联质谱测定猪尿 中β-受体激动剂。
[0025] 其中，在一些实施方案中，所述液相色谱-串联质谱测定方法中所述液相色谱法 色谱条件为以十八烷基硅烷为固定相，以1%。甲酸水溶液为流动相Α，以1%。甲酸乙腈溶液 为流动相Β，流速为0. 2mL/min，30°C，进样5μL，梯度洗脱。
[0026] 进一步的，所述液相色谱法中所述梯度洗脱的洗脱程序为Β相初始浓度为8%， Omin~8min，8%线性变化至 30% ;8min~10min，30%线性变化至 60% ;10min~12min， 60%线性变化至95% ; 12min~13min，维持95% ; 13min~13.lmin，95%线性变化至5%。
[0027] 在一些实施方案中，所述液相色谱-串联质谱测定方法中所述质谱条件为离子源 为ESI(+)，离子源接口电压3. 5kV，3.OL/min雾化，20L/min氮气干燥，以氩气为碰撞气，脱 溶剂管温度250°C，加热模块温度450°C，检测器电压1.lkV，进行多反应监测扫描。
[0028] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种检测猪尿中受体激动剂的方法。本 发明所述检测猪尿中β-受体激动剂的方法为猪尿样品经含氨水的乙腈稀释，与无水硫酸 钠和氯化钠混匀后离心，取上清液用分散式固相萃取，高速离心分离沉淀，甲醇-〇. 1%甲 酸水溶液溶解沉淀，微孔滤膜过滤，以液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。本发明所述 检测猪尿中β-受体激动剂的方法利用分散式固相萃取，吸附杂质、净化样品，而猪尿样品 β-受体激动剂不被吸附，能够一次性检