一种奥贝胆酸及其制剂中有关物质的检测方法与流程

背景技术：
：奥贝胆酸(obeticholicacid，OCA)，化学结构式如下：化学名为：6α-ethyl-3α,7α-dihydroxy-5β-cholan-24-oicacid，属法尼醇X受体激动剂。2014年5月，美国FDA授予Intercept制药公司的奥贝胆酸快速审批通道认定。奥贝胆酸通过活化法尼醇X受体，间接抑制细胞色素7A1(CYP7A1)的基因表达。由于CYP7A1是胆酸生物合成的限速酶，因此奥贝胆酸可以抑制胆酸合成，用于治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。在过去的数年里，经实验结果表明，奥贝胆酸在原料合成、制剂生产和存放等过程中，都有可能引入残留原料及其他有关物质，在储存过程中还有可能产生一些降解产物。因此，要严格控制产品质量。目前国内还未见有奥贝胆酸分析方法的文献报道，该药物也没有统一的药物标准，因此，为了更好地控制奥贝胆酸产品的质量，需要建立一套简单可靠并稳定有效的方法来进行本品的有关物质进行检测，解决合成工艺引入的或者降解及制剂加工过程产生的各类已知或未知杂质对产品纯度测定的干扰。本发明采用普通的色谱柱(C18色谱柱)，检测波长240nm，柱温22℃，流速1.0ml/min，色谱条件的流动相由0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH值＝3.8)-乙腈-甲醇组成，其配比为：25:35:40，等度洗脱方式，有效地对奥贝胆酸及其相关制剂进行含量和有关物质检测，可快速准确的检测出奥贝胆酸的杂质及其降解产物，操作简介，灵敏度高，可较好地控制产品质量。实现了奥贝胆酸有关物质的测定，保证了奥贝胆酸的质量控制，在合成和制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种奥贝胆酸及其制剂中有关物质的检测方法。本发明有关物质检测方法的实现包括以下步骤：(1)色谱条件：普通C18柱，检测器采用二极管阵列检测器，柱温22℃，流速1.0ml/min，色谱条件的流动相由0.01mol/LNaH2PO4溶液-乙腈-甲醇组成，其配比为：25:35:40。理论踏板上按奥贝胆酸峰计算不低于3000。(2)供试品溶液的配置；取奥贝胆酸或其制剂、中间体和各个杂质适量，加流动相配置成0.2mg/ml的溶液，作为供试品溶液。(3)对照品溶液的制备：量取(2)供试品溶液适量，加流动相稀释成每1ml中约含2ug的溶液，作为对照溶液。(4)测定方法：取对照溶液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10％，再取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图至奥贝胆酸保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液中主峰的峰面积。本发明上述(2)中供试品溶液的制备：取奥贝胆酸对照品适量，用流动相配置成浓度为每1ml含0.2mg的溶液，再分别用流动相稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样10μl，使之产生主峰为基线噪音三倍的信号。经试验，最小检知量为0.2ng(S/N≥3)，若以有关物质检查时的浓度0.2mg.ml计算，期检出限度为0.1％。本发明上述(3)中对照品溶液的指标：精密量取上述供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加流动相溶剂并稀释至可得，作为对照溶液。当该对照溶液浓度范围在1～10μg/ml内时，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其线性相关系数为0.9998(见附图1)。本发明奥贝胆酸及其制剂中有关物质的检测方法，经多次试验证实，其有关物质检测的高效液相色谱图中，主峰及个杂质峰，峰形对称，分离效果好(R＞1.5)，适用于各种需要进行有关物质检测的奥贝胆酸及含奥贝胆酸的相关制剂，如奥贝胆酸片。本发明与已有技术相比的积极效果在于：1、本发明中液相色谱条件的优越性更强，适用于原料药及其各种剂型有关物质的检测，可快速准确的检测出奥贝胆酸的杂质和降解产物情况。在奥贝胆酸及其制剂的有关物质检测中，各峰形对称，分离度高，避免了出现前沿峰、个别峰分离度不够等问题。2、本发明使用二极管阵列检测器对产品进行有关物质检测，建立了一种快速直观的评价色谱峰纯度的有效防范。可直观的判断色谱峰的纯度，并判断存在干扰费的位置，能够获得“在流”的全部光谱信息，快速得到色谱组分的吸收光谱，二极管阵列检测器叫一般紫外检测器，优点在于不仅能依靠色谱的保留时间进行定性，而且能够根据其提供的光谱信息进行定性，大大提高了定性的可信度和检测灵敏度。3、本发明检测方法准确，操作简捷，重现性好，灵敏度高，可以充分满足有关物质检测和分解产物测定的要求，比较好地控制样品中的特殊杂质，保证产品质量，在工作中实用性强。有利于工业化生产中，奥贝胆酸有关物质的检测，能更好的控制产品质量，保证药品安全性。具体实施方式：实施例一1、色谱条件与系统适用性实验：1.1色谱条件的选择：仪器：岛津：LC-20AT，SPD-M20A，SIL-20A，DGU-20A5，其最佳柱温22℃，流速1.0ml/min。液相色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，参照相关文献并结合实验具体情况，先后选用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-乙腈、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸盐缓冲液等多种条件，最终确定0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH3.8)-乙腈-甲醇组成，其最佳配比为：25:35:40。进样量10μl。在该色谱条件下，奥贝胆酸主峰保留时间适中，峰形较好。1.2灵敏度测定取奥贝胆酸对照品适量，用流动相配置成浓度为每1ml含0.2mg的溶液，再分别用流动相稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样10μl，使之产生主峰为基线噪音三倍的信号。经试验，最小检知量为0.2ng(S/N≥3)，若以有关物质检查时的浓度0.2mg.ml计算，期检出限度为0.1％。结果证明，该方法灵敏度高，可以充分满足有关物质检查测定的要求。1.3溶液稳定性去同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、10小时分别进样测定，其主峰峰面积及有关物质测定结果在10小时内基本稳定。以上实验结果表明，此方法简便灵敏，重现性好，可较好地对样品中奥贝胆酸的质量进行较好的检测。1.4供试品溶液的配置；取奥贝胆酸或其制剂、中间体和各个杂质适量，加流动相配置成0.2mg/ml的溶液，作为供试品溶液。1.5对照品溶液的制备：量取上述1.4供试品溶液适量，加流动相稀释成每1ml中约含2μg的溶液，作为对照溶液。1.6奥贝胆酸及其制剂有关物质的检测：取对照溶液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10％，再取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图至奥贝胆酸保留时间的2倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液中主峰的峰面积。奥贝胆酸原料药有关物质的定性测定结果如图2。实施例二：奥贝胆酸片有关物质的测定取本品20片，精密称定，研细，精密量取适量(约相当于奥贝胆酸2mg)。加流动相配置成每1ml中含0.2mg的溶液，滤过，取滤液作为供试品溶液。精密量取适量，加流动相稀释成每1ml中约含2μg的溶液，作为对照溶液。在下列选的的色谱条件下：二极管阵列检测器(岛津：LC-20AT，SPD-M20A，SIL-20A，DGU-20A5)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH3.8)-乙腈-甲醇组成，其最佳配比为：25:35:40，色谱柱柱温22℃，流速1.0ml/min。理论踏板上按奥贝胆酸峰计算不低于3000。测定结果如图3。批号第一批第二批第三批有关物质0.120.150.17附图说明图1.奥贝胆酸杂质限度线性关系图图2.实施例一奥贝胆酸所得的定性液相色谱图图3.实施例二奥贝胆酸片所得的定性液相色谱图。当前第1页1 2 3