本发明涉及药物化学领域，具体涉及奥贝胆酸衍生物及其制备方法与在制药中的用途，尤其涉及奥贝胆酸衍生物在制备预防或治疗FXR-介导的疾病或状况的药物中的用途，其中，所述 FXR-介导的疾病或状况选自慢性肝病，胃肠疾病，肾病，心血管疾病，淤胆失调，代谢疾病；优选地，所述肾病为糖尿病肾病；所述心血管疾病选自动脉硬化，血脂障碍，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，其中动脉硬化为动脉粥样硬化。
背景技术：
奥贝胆酸是一种半合成的鹅去氧胆酸，也是法尼酯衍生物X受体的特异性激动剂，动物试验已证明其改善IR和减轻肝脏脂肪含量的作用。
临床试验证明了奥贝胆酸除增加胰岛素敏感性外，尚可改善肝脏炎症和纤维化水平，并有一定的减轻体质量作用阻司。
类法尼醇X受体(FXR)最初是孤儿核受体(orphan nuclear receptors)，其首次从鼠肝cDNA文库被鉴定(B.M Forman等，Cell. 81：687-693 (1995))，它们是配体激活的转录因子核受体的家族成员，包括类固醇、类视黄醇和甲状腺激素的受体(D.J．Mangelsdorf等，Cell. 83:841-850 (1995)).
如W0 00/37077所描述的，几种天然型的胆汁酸(特别是鹅胆酸、脱氧胆酸、石胆酸(litocholic acids)以及与牛磺酸和甘氨酸的相关轭合物）结合在一起并以生理浓度激活FXR。还认为FXR参与调节胆汁酸和胆固醇的内稳态。
近来已经将法尼酯X受体(FXR)以及孕烷X受体(PXR)鉴定为胆汁酸的特舁性核受体。通过法尼酯X受体的活化，胆汁酸抑制胆汁酸合成作用中的所述限速酶的表达，其中所述的限速酶是胆固醇7a-羟化酶(Cyp7a)。胆汁酸对孕烷X受体的活化同时引发了所述胆固醇7a-羟化酶的表达以及所述胆汁酸代谢酶细胞色素P4503a的转录诱导(transcriptional induction)。还己知在高浓度下的胆汁酸对于细胞介导的免疫性以及巨噬细胞的功能会表现出免疫抑制作用。胆汁酸包括脱氧胆酸(DCA)以及鹅脱氧胆酸(CDCA)，已经证明它们对于存在于巨噬细胞中的细胞因子的脂多糖(LPS)诱导型升高具有抑制活性，其中所述的细胞因子包括白细胞介素(11)-l，白细胞介素-6，以及肿瘤坏死因子Q (TNF Q)。
奥贝胆酸的另一不足是该药尚有半衰期短，口服利用率不高的缺陷。
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于通过对奥贝胆酸的结构改造，合成了一系列奥贝胆酸衍生物的新化合物，化合物进入体内后的半衰期显著延长，口服利用率明显提高。
技术实现要素：
：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计、合成新型奥贝胆酸衍生物，从而开发疗效好、副作用小的用于预防或治疗FXR-介导的疾病的新的药物。
具体而言，本发明第一方面提供了具有以下式(I)所示的奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体。
本发明第二方面提供制备本发明第一方面所述奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体的方法。
本发明第三方面提供制备本发明第一方面所述奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体。
本发明第四方面提供了本发明第一方面所述奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体在用于预防或治疗FXR-介导的疾病或状况的药物中的用途，其中，所述 FXR-介导的疾病或状况选自慢性肝病，胃肠疾病，肾病，心血管疾病，淤胆失调，代谢疾病；优选地，所述肾病为糖尿病肾病；所述心血管疾病选自动脉硬化，血脂障碍，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，其中动脉硬化为动脉粥样硬化。
本发明第五方面提供一种药物组合物，其包括临床有效剂量的本发明第一方面所述奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体以及任选的药学可接受的载体。
附图说明
图1为试验例2药代动力学评价
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明第一方面提供了具有式(I)所示的式(I)所示的奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体，
（I）
其中：
m 为0至1的整数；
n 为0至6的整数；
R1或R2是独立是氢或C1-C8烷基或任选地取代的C1-C8烷基；
R3或R4是独立是氢， ， ，或 ；
（波浪线表示连接位置）；其中R5为氨基酸侧链基团，所述氨基酸选自：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丙酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸；其中所述氨基酸包括D氨基酸、L氨基酸以及DL氨基酸。
R6或R7独立地是氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10烷氧基、芳基 C1-C10烷基、卤素、酰氨基、磺酰氨基、酰氧基或 C(O)R’，其中所述 R’为氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10烷氧基、芳基 C1-C10烷基、卤素、酰氨基、磺酰氨基或酰氧基。
本发明提供奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体，其中所述化合物中具有代表性的化合物如下：
化合物1-1：
化合物1-2：
化合物1-3：
化合物2-1：
化合物2-2：
化合物2-3：
化合物3-1：
化合物3-2：
化合物3-3：
化合物4-1：
化合物4-2：
化合物4-3：
化合物5：
化合物6-1
化合物6-2
化合物6-3
化合物7：
化合物8：
化合物9：
化合物10：
化合物11
化合物12
。
本发明所用术语“药用盐”指可保留母体化合物预期生理活性而不会产生任何意料之外毒副作用的盐，例如：盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐、磷酸盐，硝酸盐，以及醋酸盐，草酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，苯甲酸盐，双羟萘酸盐，海藻酸盐，甲磺酸盐，萘磺酸盐、钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、胆碱盐、葡甲胺盐等。
所述的溶剂化合物为水合物、醇合物等。
选择和制备药物可接受的盐或溶剂化合物等是本领域技术人员公知技术。
根据本发明的具体实施方式，本发明的化合物1-6可以通过下述方式制备：
根据本发明的具体实施方式，本发明的化合物7、化合物8可以通过下述方式制备：
根据本发明的具体实施方式，本发明的化合物9、化合物10可以通过下述方式制备：
根据本发明的具体实施方式，本发明的化合物11、化合物12可以通过下述方式制备：
本发明还提供含有本发明奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体，在制备用于预防或治疗FXR-介导的疾病或状况的药物中的用途，其中，所述 FXR-介导的疾病或状况选自慢性肝病，胃肠疾病，肾病，心血管疾病，淤胆失调，代谢疾病；优选地，所述肾病为糖尿病肾病；所述心血管疾病选自动脉硬化，血脂障碍，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，其中动脉硬化为动脉粥样硬化。
本发明还提供含有本发明奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体的药物组合物，其包括临床有效剂量的本发明奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、多晶型体、外消旋混合物或对映体以及任选的药学可接受的载体。本发明所获得的奥贝胆酸衍生物或其药用盐、溶剂化合物、外消旋混合物或对映体可以单独或以药物组合的形式给药。本发明药物组合可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用一种或多种生理上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。
给药途径可以是口服、非肠道或局部给药，优选口服和注射形式给药。可以口服的给药制剂包括胶囊剂、颗粒剂和片剂等。患者吞咽有困难时，也可以采用舌下片或者其它非吞咽的方式给药。本发明化合物也可以用于配制用于胃肠外给药或者透皮给药或者经黏膜给药。或者采用栓剂或者埋植剂的方式给药。本领域技术人员可以理解，本发明化合物可以采用合适的药物释放系统以得到更有利的效果。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、健康状况、营养状况、化合物的活性强度、使用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医生的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～60mg/kg；最好24小时的给药量为每公斤0.05～30mg，也可采用几次给药方式。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
实施例1：化合物1-1的合成
在水浴条件下，Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(44mmol，15.2g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用无水二氯甲烷 (30ml) 搅拌溶解。随后加入6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物8.3g；化合物1。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
实施例2：化合物1-2的合成
合成方法参考实施例 1，用Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-D-赖氨酸替换 Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸。得到化合物1-2。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
实施例3：化合物1-3的合成
合成方法参考实施例 1，用Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-DL-赖氨酸替换 Nα-叔丁氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸。得到化合物1-3。
ESI-MS m/z：676（M+1）+
实施例4：化合物2-1的合成
在水浴条件下，Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸盐酸盐(44mmol，15.2g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用无水二氯甲烷 (30ml) 搅拌溶解。随后加入6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物7.9g；化合物2收率72.3%。
ESI-MS m/z：732（M+1）+
实施例5：化合物3-1的合成
在水浴条件下，Nα-叔丁氧羰基-Nim-三苯甲基-L-组氨酸(44mmol，15.2g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用无水二氯甲烷 (30ml) 搅拌溶解。随后加入6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物7.0g；化合物3收率64.0%。
ESI-MS m/z：694（M+1）+
实施例6 ：化合物4-1的合成
在水浴条件下，N-叔丁氧羰基-N'-(2-氯苄氧羰基)-L-鸟氨酸(44mmol，15.0g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用无水二氯甲烷 (30ml) 搅拌溶解。随后加入6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物8.1g；化合物4收率74.1%。
ESI-MS m/z：648（M+1）+
实施例7 ：化合物5的合成
在水浴条件下，Nα- 叔丁氧羰基-甘氨酸(44mmol，14.6g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，用无水二氯甲烷 (30ml) 搅拌溶解。随后加入6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物7.8g；化合物5收率71.4%。
ESI-MS m/z：534（M+1）+
实施例8 ：化合物6-1的合成
在水浴条件下，将6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氢呋喃中，加入2gNaH，搅拌2h，加入Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸盐酸盐(22mmol，7.6g)、N，N’-二环己基碳二亚胺(4.4mmol，0.91g)、4-二甲胺基吡啶(2.2mmol，0.3g)，常温搅拌过夜。过滤除去固体不溶物，滤液蒸干溶剂；加乙醚到残余物中，过滤除去溶液中的不溶杂质。滤液浓缩，以乙醚为展开剂快速过柱，收集产物馏分。减压浓缩得产物7.8g；化合物6-1收率71.4%。
ESI-MS m/z：576（M+1）+
实施例9：化合物6-2的合成
合成方法参考实施例8，用Nα-叔丁氧羰基-D-精氨酸盐酸盐替换 Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸盐酸盐。得到化合物6-2。
实施例10：化合物6-2的合成
合成方法参考实施例8，用Nα-叔丁氧羰基-精氨酸盐酸盐替换 Nα-叔丁氧羰基-L-精氨酸盐酸盐。得到化合物6-3。
实施例11：化合物7的合成
6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)，丁二酸酐 (4.8g，48mmol) 依次加入甲苯 (100mL)中，然后加入 4-(N，N- 二甲基氨基 )吡啶（1.22g，10mmol) 反应混合液在70～90℃搅拌 8个小时，减压去除溶剂，并浓缩至干将残余物通过HPLC分离（TFA）系统，得到产物6.3g；化合物7收率75.0%。
ESI-MS m/z：620（M+1）+
实施例11：化合物8的合成
在水浴条件下，将6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氢呋喃中，加入2gNaH，搅拌2h，加入丁二酸酐 (2.4g，24mmol) ， 4-(N，N- 二甲基氨基 )吡啶（1.22g，10mmol) 反应混合液在70～90℃搅拌 8个小时，减压去除溶剂，并浓缩至干将残余物通过HPLC分离（TFA）系统，得到产物6.2g；化合物8收率56.3%。
ESI-MS m/z：520（M+1）+
实施例12 ：化合物9的合成
将6-乙基鹅去氧胆酸(5.0g,14.8mmol)和 TEA(6.0g,59.2mmol)在无水DCM(50mL) 中的搅拌溶液中逐滴加入三氯氧磷(5.3g,36mmol)然后在室温下搅拌该混合物12小时，用水淬灭反应。用 NaHCO3溶液和盐水洗涤有机层，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干。用硅胶柱以 (PE:EA=30:1-1:1) 纯化残余物，得产物2.6g,化合物9收率23.6%。
ESI-MS m/z：580（M+1）+
实施例13 ：化合物10的合成
在水浴条件下，将6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氢呋喃中，加入2gNaH，搅拌2h，加入 TEA(6.0g,59.2mmol)在无水DCM(50mL) 中的搅拌溶液中逐滴加入三氯氧磷(2.6g,18mmol)然后在室温下搅拌该混合物12小时，用水淬灭反应。用 NaHCO3溶液和盐水洗涤有机层，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干。用硅胶柱以 (PE:EA=30:1-1:1) 纯化残余物，得产物3.1g,化合物10收率28.1%。
ESI-MS m/z：500（M+1）+
实施例14 ：化合物11的合成
在-10℃和N2下，加入6-乙基鹅去氧胆酸(4.8g,14.1mmol)和NaI(4.30g,28.2mmol) 在无水THF(18mL)中的搅拌溶液中逐滴加入 LHMDS(42.3mL,THF中1.0M,28.5mmol)，然 后 在 室 温 下 搅 拌 该 混 合 物 30分钟，之后加入二叔丁基氯甲基磷酸酯(2.0g,48mmol)，再搅拌10小时。用NH4Cl溶液淬灭反应，用 EA 萃取。用 NaHCO3溶液和盐水洗涤有机层，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干。用硅胶柱以(PE:EA=50:1-3:1)纯化残余物，得产物2.6g,47%。
在 0℃下，加入上述得到的产物(2.5g,4.47mmol) 在无水 DCM(14mL) 中的溶液中加入TFA(8.3mL)。然后搅拌该混合物30分钟，在减压下去除溶解，并浓缩至干。将残余物通过HPLC分离 (TFA) 系统，得到化合物11(1.2g,40%)，为白色固体。
ESI-MS m/z：640（M+1）+
实施例15 ：化合物12的合成
在水浴条件下，将6-乙基鹅去氧胆酸 (26mmol，10.93g)溶解在40ml四氢呋喃中，加入2gNaH，搅拌2h，加入NaI(4.30g,28.2mmol) 在无水THF(18mL)中的搅拌溶液中逐滴加入 LHMDS(22mL,THF中1.0M,14.3mmol)，然 后 在 室 温 下 搅 拌 该 混 合 物 30分钟，之后加入二叔丁基氯甲基磷酸酯(2.0g,48mmol)，再搅拌10小时。用NH4Cl溶液淬灭反应，用 EA 萃取。用 NaHCO3溶液和盐水洗涤有机层，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干。用硅胶柱以(PE:EA=50:1-3:1)纯化残余物，得产物2.5g,45%。
在 0℃下，加入上述得到的产物(2.5g,4.47mmol) 在无水 DCM(14mL) 中的溶液中加入TFA(8.3mL)。然后搅拌该混合物30分钟，在减压下去除溶解，并浓缩至干。将残余物通过HPLC分离 (TFA) 系统，得到化合物12(1.1g,35%)，为白色固体。
ESI-MS m/z：530（M+1）+
比较实施例1：化合物G的制备（CN 104672290 A）
制备方法：在0℃下向化合物(III)(5.52g,30.9mmol) 的 DCM(100mL)溶液中添加Et3N(12.5g,124mmol) 和 Ac2O(9.49g,93mmol)。混合物在0℃下搅拌1小时，室温下搅拌3小时。逐滴加入DMAP(7.53g,61.8mmol)的 DCM(100mL) 溶液。混合物在 45℃下搅拌10小时。然后通过DCM(1000mL) 稀释，通过水(1000mL)和盐水(1000mL) 洗涤，以Na2SO4干燥，过滤，浓缩。粗产品在硅胶上通过柱色谱纯化 (以 PE/EtOAc ＝ 50:1至10:1洗脱 )，以获得化合物6
的白色固体 (6.3g,75％ )。
向化合物6(5.0g,9.9mmol)的DCE(100mL)溶液中添加NIS(3.46g,20mmol)。混合物在500W钨丝电灯泡下回流4小时。形成的混合物逐滴加入到NaHSO3溶液中。然后通过 DCM(1000mL) 稀释，通过水(400mL)和盐水(300mL)洗涤，以Na2SO4进行干燥，过滤，浓缩。粗产品在硅胶上通过柱色谱纯化(以PE/EtOAc＝50:1至30:1洗脱)，以获得化合物7的淡黄色油状物 (2.6g,47％ )。
将化合物7(2.5g,4.9mmol) 的 P(OEt)3(22.6mL) 溶液回流5小时。冷却混合物，浓缩以获得残渣。通过制备薄层层析 (PE/EtOAc＝2:1)纯化，以获得化合物8(1.9g,76％ )的无色油状物。(I2作为 TLC 染色剂 )。
在0℃下向化合物8(1.8g,3.5mmol)DCM(22.5mL)溶液中添加TMSI(2.4g,12.4mmol)。混合物在室温下搅拌12小时，浓缩该混合物。向残渣中添加NaOMe(1.8g,33.3mmol)的MeOH(36mL) 溶液。形成的混合物在60℃下搅拌 10小时。然后通过DCM(90mL) 稀释，通过水(45mL)洗涤。将无机层调节至 PH＝3，浓缩以获得固体。将固体在MeOH中稀释，过滤。浓缩过滤物，以获得残渣，通过制备型高效液相色谱纯化，以获得目标化合物G(1.0g,45.7% ) 的白色固体。
ESI-MS m/z：456（M+1）+
试验例1：生物活性
通过离体检测评价发明所述的化合物对于TGR5受体的效能以及效力。参见，Kawamata于2003年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》Vol.（卷）278，NO.（期）11，p.9435-9440中发表的文献）。利用荧光共振能量转移技术（FRET）检测对于法尼酯X受体（FXR）的活性，利用不含细胞的酶联免疫吸附试验（EliSA）向人类法尼酯X受体中补充SRC-1（类固醇受体活化因子-1）肽。参见，Blanchard等人的WO 00/37077，结果见下表。
结果显示；本发明所述的化合物是有效的X受体的特异性激动剂。化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12的生物活性与奥贝胆酸相比略好或基本一致。
试验例2:药代动力学评价
对本发明化合物(化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12)与比较实施例化合物（化合物G）进行体内药代动力学评价。
方法：
发明化合物(化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12)与比较实施例化合物（化合物G）分别以10g/L的浓度溶于空白溶液(30％PEG-400)中。
实验动物为雄性小鼠，6至8周龄，体重190-215克，购自购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。基于小鼠体重随机分成13组，每组3只动物。各组小鼠的给药剂量和途径见下表。
在药代动力学试验前，将小鼠禁食16小时。然后按照表中所示经口服(15mg/kg) 给药单个剂量的化合物。采取颈静脉穿刺的方式在给药后定时收集血液 200μL，其中对于经静脉给药的动物组，在给药后 0、15 分钟、30 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、8 小时和 24 小时收集血液。将血样收集于具有 EDTA 的样品管中，立即在 4℃下以 4000rpm 离心血样5分钟，然后将血浆转移到另一个样品管中，储存于-20摄氏度下。
对样品进行药代动力学检验，采用的方法和仪器如下：
HPLC ：Dionex U-3000（Thermo 公司)
System(SerialNO:4353) ；
MS：AB API4000Q Trap LC/MS/MS instrument(Serial NO.AR19020706)
柱子：Phenomenex Luna 5μC18(2.0×50mm)
流动相：95%乙腈 (0.1%甲酸)和5%乙腈(0.1%甲酸)
定量方法：内标法
本发明化合物(上述实施例制备)与比较实施例化合物（比较实施例制备）药代动力学结果下表。
NA：数据未得。
结果下表显示，化合物1-1、化合物2-1、化合物3-1、化合物4-1、化合物5、化合物6、化合物7、、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12的半衰期，均比之前公开的化合物G的半衰期显著延长。生物利用率比化合物G提高了2～3倍，其中，化合物7的半衰期长达27.5小时，其药代动力学图谱见图 1。