一种多受体激动剂po13及应用
【专利说明】一种多受体激动剂P013及应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种多受体激动剂P013及应用。
【背景技术】
[0003]胃泌酸调节肽(oxyntomodulin，OXM)是由胰高血糖素原基因在肠道L细胞和中枢神经元内转录加工后得到的37个氨基酸组成的脑肠肽。0ΧΜ通过同时激活胰高血糖素样月太-1 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体和膜高血糖素受体(glucagon receptor,GCGR)发挥显著抑制食欲，减少能量摄入，增加能量消耗，促进胰岛素释放及远期β细胞保护的功能。其中GLP-1R介导的有效降低血糖和保护胰岛β细胞的功能，是目前糖尿病药物开发的重要靶点。
[0004]垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitaryadenylate cyclase activatingpolypeptide, PACAP)是由垂体分泌的、或目的组织自分泌和旁分泌的、具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽(vasoactive intestinalpeptide)家族中的新成员。PACAP的具有3个B类G蛋白偶联受体:PAC1_R是PACAP的特异受体；VPAC1-R和VPAC2-R是PACAP和VIP的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP具有显著的抗细胞凋亡，调节细胞增殖分化；神经保护和促进神经修复；调节血管功能；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动调节能量代谢平衡；调节内分泌平衡；促进觉醒，帮助提升学习和记忆能力；等的作用。目前已有研究显示PACAP是预防与治疗神经退行性疾病的潜在药物，如阿尔兹海默症病人中脑部的PACAP显著下调，提示补充PACAP及其相关多肽可有效预防与治疗阿尔兹海默症。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在生物信息学分析的基础上，构建同时具备0ΧΜ和PACAP活性的短肽，或者说既能增强0ΧΜ活性，又能增强PACAP活性的短肽；本发明首次化学合成0ΧΜ与PACAP高度同源的N端13个氨基酸的多受体激动剂P013，
其氨基酸序列如SEQ N0.1所示；并且首次尝试检测其体内生物学功能。
[0006]SEQ N0.1:His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys TyrD
[0007]我们通过生物信息学分析方法，将0ΧΜ与PACAP进行比对后发现:它们的N端13个氨基酸高度同源，如图1所示，提示13个氨基酸可能承载0ΧΜ与PACAP共同的作用。并且作为内源性的多肽类激素，0ΧΜ和PACAP均容易受到体内二肽基肽酶_4 (dipeptidylpeptidase -4，DPP-4)的对多肽N端的水解，造成活性减退和丧失，甚至形成自身的抑制剂；因此体内额外补充0ΧΜ和PACAP的N端高同源性的13氨基酸组成的短肽，可能有效稀释DPP-4对0ΧΜ和PACAP的降解作用，从而同时增强0ΧΜ和PACAP的相关活性。
[0008]研究发现P013具有:同时有效激活0ΧΜ受体(GLP-1R和GCGR)和PACAP的相关受体(VPAC1/2和PACAP)，是一个多向受体的激动剂；同时具备0ΧΜ和PACAP的生物学功能；显著抑制摄食，降低体重，提高机体糖耐受，具有治疗肥胖、糖尿病等能量代谢失调疾病的潜能；并且显著抑制东莨菪碱诱导的学习记忆损伤，降低脑部氧化损伤，提高脑部神经递质活性，提高觉醒，促进学习记忆；而且有效抵抗抑郁产生；能够同时抵抗谷氨酸钠造成的摄食障碍、肥胖、神经损伤与抑郁；具有治疗神经退行性疾病及抑郁症的潜能；因此P013具备同时治疗能量代谢失调如肥胖、糖尿病合并神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症；及(或)抑郁症及(或)学习记忆功能衰退等疾病。
[0009]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明的多肽是0ΧΜ与PACAP的N端具有高度同源性的13个氨基酸，同时激活0ΧΜ与PACAP的受体，同时具备0ΧΜ与PACAP生物学活性，因此具有一石多鸟的作用；能同时用于治疗肥胖、糖尿病等的能量代谢失调疾病，兼并阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病及(或)抑郁症及(或)学习记忆功能衰退等疾病。13个氨基酸组成的P013短肽采用化学合成，成本低廉；而且序列完全来自体内多肽，几乎不产生免疫反应；因此适用于长期大量的使用。
【附图说明】
[0010]图1为P013序列的设计思路；
图2为化学合成P013的质谱图(A)和高效液相纯度分析图(B);
图3为P013的受体选择性鉴定，(A)P013有效竞争[125Ι] 0ΧΜ对GLP-1R和GCGR的结合，(B) P013 有效激活 PAC1R、VPAC1R 和 VPAC2R ；
图4为P013抑制摄食(A)、减低体重(B)；
图5为P013有效提尚糖耐受，减低血糖指数；
图6为P013保护脑部抗氧化(A)、提高脑部神经递质活性(B);
图7为P013抑制东莨菪碱诱导的学习记忆损伤(A)并且缩短悬尾绝望模型的不动时间(B);
图8为P013抑制谷氨酸钠诱导的肥胖、神经损伤与抑郁:抑制体重增加(A)，减低脑部脂质过氧化物水平(B)，缩短被迫游泳的静止时间(C)及延长避暗实验的潜伏期(D)。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0012]实施例1:P013的化学合成与鉴定
P013的序列为:HSQGTFTSDYSKY，如SEQ N0.1所示；采用化学合成的方法制备，P013序列的设计思路如图1。如图2A所示，质谱结果显示化学合成多肽分子量为1520.59，与理论值相符；HPLC结果显示纯度大于99% (图2B)。
[0013]实施例2: P013是多向激动剂
受体竞争性结合实验结果表明:如图3A所示，P013竞争1251标记的0ΧΜ对GLP-1R的半有效浓度EC5。为35.1 ±2.3nM，而对GCGR的EC 50为23.1 ± 1.9nM，因此P013与0ΧΜ相同，既能激活GLP-1R又能激活GCGR。
[0014]如图3B所示，P013均有效促进分别高表达PACUVPAC1和VPAC2的CH0细胞的增殖，而且活性与浓度呈正比，显示P013能同时有效激活PACAP的3个受体。
[0015]综上所述，P013能够有效激活0ΧΜ和PACAP的受体，是两者的有效替代物。
[0016]实施例3: P013有效抑制摄食、降低体重
小鼠禁食过夜后，腹腔注射lOnmol/kg P013后给予食物，没隔lh测定消耗的食物量，共计6h，已注射生理盐水(saline)作为对照，结果如图4A显示，P013显著抑制了小鼠摄食量(*，？〈0.01，P013 vs.saline);小鼠连续腹腔注射 P013 (10nmol/kg/d) 14 天后，测定小鼠的体重，结果如图4B所示，与注射生理盐水相比，P013显著减轻了小鼠的体重(*，ρ〈0.01, Ρ013 vs.saline)。
[0017]实施例4: P013有效提尚糖耐受，减低血糖指数
当P013 (lOnmol/kg)与高浓度葡萄糖(5mg/kg)共同腹腔注射小鼠，收集注射前(Oh)和注射后0.5-2h内每隔0.5h的血糖，血糖指数(如图5)显示，与生理盐水相比，P013显著降低了血糖指数(*，p〈0.01，P013 vs.saline)，提高机体处理高糖的能力。
[0018]实施例5: P013降低脑部氧化水平，提高神经递质活性
小鼠连续腹腔注射P013 (10nmol/kg/d) 14天后，对小鼠脑部的脂质过氧化物(MDA)的测定显不，P013注射小鼠脑部氧化水平显著降低(图6A，*，p〈0.01，P013 vs.saline)，并且分解神经递质的乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶浓度显著降低，提示脑部神经递质浓度提高(图 6B，*，ρ〈0.01, Ρ013 vs.saline)。
[0019]实施例6:P013提高学习记忆能力和抵抗抑郁
小鼠连续腹腔注射P013 (10nmol/kg/d)14天后，东莨菪碱(Scop) (3mg/kg)注射小鼠，小鼠避暗实验测定小鼠潜伏期，发现如图6A所示，P013有效提高延长小鼠避暗实验的潜伏期，抵抗东莨菪碱对学习记忆的损伤(图7A，*，p〈0.01，P013 vs.Scop)。进行悬尾绝望实验，发现在5min内P013显著减少悬尾后的不动时间(图7B，*，p〈0.01，P013 vs.saline)，显示P013具有抑制抑郁的功能。
[0020]实施例7:P013同时抑制肥胖与神经损伤及抵抗抑郁
高剂量谷氨酸钠不仅诱导肥胖，而且导致脑部神经损伤并造成抑郁，利用谷氨酸钠诱导的小鼠肥胖模型，发现P013能够有效抑制谷氨酸钠造成的体重增加(图8A，*，p〈0.01，Glu+P013 vs.Glu)、降低大脑海马区的脂质过氧化物(MDA)的水平(图8B，*，ρ〈0.01，Glu+P013 vs.Glu)，减少小鼠被迫游泳的抑郁实验的不动时间(图8C，*，p〈0.01，Glu+P013vs.Glu)，并且提高小鼠的避暗实验的认知测定的潜伏期(图8D，*，p〈0.01，Glu+P013 vs.Glu);因此，证明P013同时具备抑制摄食障碍、肥胖等代谢失调兼和抵抗神经损伤，提高认知与预防抑郁症的活性。
【主权项】
1.一种多受体激动剂P013，其氨基酸序列如SEQ N0.1所示:His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys TyrD2.权利要求1所述多受体激动剂P013在制备与0XM和PACAP相关的合并症疾病治疗药物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为能量代谢失调疾病或合并神经退行性疾病。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能量代谢失调疾病为肥胖或糖尿病。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述合并神经退行性疾病为阿尔兹海默症、帕金森症、抑郁症或学习记忆功能衰退。
【专利摘要】本发明公开了一种多受体激动剂PO13及应用。序列为His？Ser？Gln？Gly？Thr？Phe？Thr？Ser？Asp？Tyr？Ser？Lys？Tyr。本发明的多肽是OXM与PACAP的N端具有高度同源性的13个氨基酸，同时激活OXM与PACAP的受体，同时具备OXM与PACAP生物学活性，因此具有一石多鸟的作用；能同时用于治疗肥胖、糖尿病等的能量代谢失调疾病，兼并阿尔兹海默症、帕金森症等神经退行性疾病及（或）抑郁症及（或）学习记忆功能衰退等疾病。13个氨基酸组成的PO13短肽采用化学合成，成本低廉；而且序列完全来自体内多肽，几乎不产生免疫反应；因此适用于长期大量的使用。
【IPC分类】C07K7/08, A61K38/10, A61P25/28, A61P25/16, A61P3/10, A61P25/24, A61P3/04
【公开号】CN105254720
【申请号】CN201510794146
【发明人】余榕捷
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月18日