T细胞表位鉴定及其重组表位疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学领域，设及一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的 CD4+T细胞表位鉴定及其重组表位疫苗，能够引起小鼠的特异性细胞免疫应答和体液免疫 应答，并对金黄色葡萄球菌感染具有良好的免疫预防作用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus,S.aureus)是一种常见的革兰氏阳性 条件致病菌，可引起人的毒素性疾病、化脈性疾病、肺炎、伪膜性肠炎、屯、包炎等，严重者可 致败血症、脈毒症等全身性感染。S.aureus也可引起动物感染，尤其是奶牛乳房炎的重要病 原菌。目前，全世界每年有几百万S.aureus感染的报道，对于S.aureus感染的治疗主要依 赖抗生素。虽然过去抗生素在治疗和控制S.aureus感染方面发挥了重要作用，但由于抗生 素的普遍和大量使用导致了耐药菌株出现，目前临床上耐药S.aureus引发的感染已成为 难W解决的棘手问题。因此，寻找一种抗S.aureus感染的新方法至关重要，而使用免疫制 剂-疫苗是防治S.aureus感染一种理想途径。目前为止，所研究的S.aureus疫苗保护效 果均不够理想，其主要原因之一是在过去的疫苗研究中只考虑了体液免疫应答作用而忽视 了WCD4叮细胞为主的细胞免疫应答，特别是化1和化17细胞免疫应答的作用。
[0003]TRAP(targetofRNAIIIactivatingprotein)是一种葡萄球菌中高度保守的蛋 白，由167个氨基酸组成，在DNA抗氧化损伤中发挥重要作用。免疫研究表明，TRAP蛋白免 疫小鼠和牛均获得良好的保护效果，由此说明TRAP是一个良好的S.aureus疫苗的候选抗 原。但TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在诱导特异性免疫应答中的作用及其制备的表位疫苗 诱导的免疫保护作用未不清楚。因此，我们对S.aureusTRAP蛋白CD4+T细胞表位进行了 鉴定，并将其与TRAP蛋白的B细胞表位制备成重组表位疫苗，我们的研究表明CD4+T细胞 表位和B细胞表位能够在小鼠体内引起特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，有助于抵抗 S.aureus的感染，有利于进一步开发S.aureus疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位。 阳0化]本发明的第二目的是提供另一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮细胞表位。
[0006] 本发明的第Ξ目的是提供上述两种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位 与TRAP蛋白的B细胞表位串联而成的重组表位疫苗PT。
[0007] 本发明通过W下技术方案来实现：
[0008] 一、一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮细胞表位，其氨基酸序列如SEQN0:1所 /J、- 〇
[0009] 上述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌 感染的疫苗中的应用。
[0010] 二、一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮细胞表位，其氨基酸序列如SEQNO: 2所 /J、- 〇
[0011] 上述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌 感染的疫苗中的应用。
[0012] 首先利用生物信息学方法预测S.aureusTRAP的CD4叮细胞表位，通过分析表位 预测结果和蛋白质二级结构确定符合条件的5条候选表位多肤序列，并送公司合成表位多 肤。
[0013] 本发明所述的抗原表位沈QNO: 1 (20NPT册LFQFSASDTSVI阳E39)和沈QNO: 2 (94RNF GGFKSY化LRPAKGTTY113)产生了较强的TRAP抗原特异性的CD4叮细胞增值，同时分泌了高水 平的细胞因子IFN- 丫和IL-17,IL-4的分泌水平一般，暗示筛选的两个TRAP优势表位属于 化1和化17型，且SEQNO: 2特异性CD4叮细胞分泌的IL-17高于TRAP全蛋白，暗示其可能 是特异性化17型细胞表位。
[0014] Ξ、一种重组表位疫苗PT，由上述的两种TRAP蛋白的CD4叮细胞表位和TRAP蛋白 的B细胞表位串联而成，每个表位的C末端用GPGPG间隔序列隔开。
[0015] 上述的重组表位疫苗PT产生了特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答，且对于 S.aureus感染的保护效果好于TRAP全蛋白，可用于S.aureus的抗感染免疫，用于制备治疗 金黄色葡萄球菌感染的疫苗。
[0016] 采用上述技术方案的积极效果：本发明的S.aureusTRAP蛋白的CD4+T细胞抗原 表位可产生特异性的细胞免疫应答，而CD4+T细胞应答在S.aureus感染的机体免疫炎性损 伤和抗感染免疫保护中发挥重要作用，因此可用于制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗； 本发明构建的含有S.aureusTRAP蛋白的CD4叮细胞表位和B细胞表位的重组表位疫苗PT 能够在小鼠体内引起特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，对S.aureus感染的小鼠具有 良好的保护效果，有利于S.aureus疫苗的进一步开发。
【附图说明】
[0017] 图1为TRAP氨基酸序列的蛋白质二级结构预测结果。 阳0化]图2为TRAP抗原表位多肤体外刺激小鼠特异性CD4叮细胞的增值结果。A:BALB/C，B:巧7BL/6。
[0019] 图3为TRAP抗原表位多肤体外刺激小鼠特异性CD4叮细胞的细胞因子 IFN-丫，比-4,比-17 的检测结果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0020] 图4为TRAP抗原表位SEQNO: 1和SEQNO: 2体内刺激小鼠特异性CD4叮细胞的 增值结果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0021] 图5为TRAP抗原表位SEQNO: 1和SEQNO: 2体内刺激小鼠特异性CD4叮细胞的 细胞因子IFN-丫，比-4,比-17的检测结果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0022] 图6为表位重组蛋白PT的构建和表达。A:表位重组蛋白PT的构建示意图和氨基 酸序列；B:重组蛋白纯化后的SDS-PAGE分析。Μ:蛋白质分子量Marker;1:表位重组蛋白 PT的纯化结果；2 :重组蛋白TRAP的纯化结果；3 :PET32a蛋白的纯化结果。
[0023] 图7为重组表位疫苗PT免疫小鼠的特异性淋己细胞的增值结果。A:BALB/c， B:C57化/6。
[0024]图8为重组表位疫苗ΡΤ免疫小鼠的特异性淋己细胞的细胞因子 IFN-丫，比-4,比-17 的检测结果。A:BALB/c，B:C57化/6。 阳0巧]图9为重组表位疫苗PT免疫小鼠血清的IgG水平。A:BALB/c;B:C57化/6。 阳0%] 图10为重组表位疫苗PT的免疫保护效果。A:BALB/c;B:C57化/6。
【具体实施方式】
[0027] W下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，运些实施例仅用于例证的 目的，绝不限制本发明的范围。
[0028] 本发明中生物材料的来源：
[0029] 1、TRAP蛋白的B细胞表位：公开在ANovelPeptideScreenedbyPhageDisplay CanMimicTRAPAntigenEpitopeagainstStaphylococcusaureusInfections,Guang Yang,YapingGao,JieDong,ChuanLiu,YanningXue,MingFan,BeifenShenand NingshengShao,TheJournalofBiologicalChemistry,Vol280,No29,IssueofJuly 22,pp27431-27435,2005。
[0030] 2、候选表位多肤为委托上海楚肤生物科技有限公司合成。 阳0川实施例1S.aureusTRAP的CD4叮细胞表位的预测 阳0巧 CD4叮细胞表位只能与Μ肥II类分子结合，并共同被T细胞抗原受体特异性识别， 从而诱导相应效应Τ细胞产生免疫应答。根据CD4+T细胞表位与血1CII类分子的结合能力， 基于矩阵的Τ细胞表位预测算法（