一种适于bhk21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体设及一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培 养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞度油州amsterSyrianKi化巧），该细胞系于 1961年由MacphersonIA和StokerMGP建系，源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾。原始的 细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性生长。它在1963年经过84天连续培养，获得单细胞克隆 细胞。最常用的是BHK21的一个亚克隆细胞，即克隆13或C13。经无数次传代后细胞可悬 浮生长，它可用于增殖各种病毒，已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系， 它还可用于兽用狂犬病毒，乙型脑炎病毒W及伪狂犬病毒等疫苗的生产和研究。
[0003] 口蹄疫由于传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的"头号杀手"。它是 由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、 热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄 部出现大量水瘤，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给 人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜W绝后患。国际上英美等发达国家都已 全面消灭了口蹄疫，在发展中国家中，中国也走在牲畜防疫的前列。我国对口蹄疫的防治， 预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。而BHK21细胞则常用于制备口蹄疫疫 苗。
[0004] 传统的BHK21细胞培养大多采用有贴壁培养方式，使用基础培养基添加10%的小 牛血清作为培养液。然而血清是由血浆去除细胞及纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合 物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，并且其成分随着供血动物的性别、 年龄、生理条件和营养条件的不同而存在质量差异，使得实验和生产过程难W实现标准化。 而且可能含有潜在的传染性物质比如支原体、真菌、病毒等，产生微生物污染，会使蛋白质 产物的下游分离纯化工作困难。此外，血清来源困难，价格昂贵，大规模动物细胞培养过程 中使用血清将会大大增加生产成本。
【发明内容】
[0005] 本发明主要提供了一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方 法，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在工业上减少了血清对细胞培养 过程的干扰，降低了生产成本，为细胞的产业化生产带来极大方便。其技术方案如下：一种 适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基，其包括W下组分：
[0006] 氨基酸部分包括W下组分：
[001引优选的，一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的组分如下：氨基酸部 分包括W下组分：
[0030] 一种适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0031] (1)取干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨1. 5-3小时，得培养基干粉；
[0032] (2)将步骤（1)制得的培养基干粉溶解于超纯水中，并进行定容，用滤菌膜过滤灭 菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培养基。
[0033] 优选的，步骤（1)中球磨时间为2小时，步骤似中滤菌膜的孔径为0. 22ym。
[0034] 采用上述培养基及其制备方法，本发明具有W下优点：
[003引 （1)本发明的培养基，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在科研 上可减少血清对实验过程和结果的干扰，在工业生产上可提高生产效率，保证产品质量，在 保留了传统工艺设备的基础上，通过降低血清的使用量减少生产成本，同时最重要的是，它 并没有改变BHK21细胞的贴壁生长状态，本发明提供的培养基适用于细胞的贴壁培养，与 微载体等其它技术结合，可在摇瓶、生物反应器等进行规模化培养，从而广泛用于工业化生 产中；
[0036] (2)本发明的BHK21细胞低血清无蛋白培养基添加2%小牛血清与基础培养基添 加10%小牛血清进行了细胞培养比较，其细胞培养的生长曲线及病毒接毒增殖能力相近， 无显著差别，本发明的培养基不改变传统生产工艺，不需更换新的生产设备，可用于现有的 国内生产。
【附图说明】
[0037] 图1为ATCC(美国模式培养物保藏所）提供的10%血清浓度条件下培养的BHK21 细胞显微镜下状态图；
[0038] 图2为使用本发明的低血清培养基在添加2%小牛血清浓度条件下连续培养两个 月的BHK21细胞显微镜下状态图；
[0039] 图3为使用本发明的低血清培养基在添加2%小牛血清浓度条件下培养的BHK21 细胞的生长曲线与使用现有的10%小牛血清DMEM高糖培养的BHK21细胞的生长曲线对比 图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。
[004引 1.培养基的配方
[0043] 表1培养基配方
[0047] 2.制备方法
[0048] (1)取配方中干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨2小时，得培养基干粉；
[004引 似将步骤（I)制得的培养基干粉溶解于900ml超纯水中，然后用超纯水定容至 比，用孔径为0. 22ym的滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培 养基，在6°C下冷藏备用。
[0050] 实施例2
[005。 本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。
[0052] 1.培养基的配方
[0053] 表2培养基配方
[0057] 2.制备方法
[0058] (1)取配方中干燥后的各组分分别装入球磨罐内，球磨1. 5小时，得培养基干粉；
[0059] (2)将步骤（1)制得的培养基干粉溶解于900ml超纯水中，然后用超纯水定容至 比，用孔径为0. 22ym的滤菌膜过滤灭菌，即得适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白液态培 养基，在8°C下冷藏备用。
[0060] 实施例3
[006。 本实施例用于制备适于BHK21细胞生长的低血清无蛋白细胞培养基。
[0062] 1.培养基的配方
[0063] 表3培养基配方
[006引 2.制备方法
[0069] (1)取配方中