采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于组织工程产品制备技术领域，具体设及一种采用人小诞腺上皮干/祖 细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 肝移植是治疗晚期肝病的有效方法之一，但缺乏供体来源、手术费用昂贵及术后 终生使用免疫抑制剂等诸多问题制约了该项技术的临床应用。因此，干细胞通过培养、诱 导、分化为肝细胞样细胞用于细胞移植、或作为生物工程化的类肝器官的种子细胞，为肝病 的治疗提供了新的治疗方法与技术，也为药物代谢与毒性试验提供了新的方法与技术。然 而，供区短缺、采集困难等严重限制了细胞的获取，对于供区细胞的储存和活性维持的适当 的细胞培养方案的缺乏等对该项技术的应用也构成了明显的障碍。
[0003] 利用取自人自体小诞腺的上皮干/祖细胞，在体外培养诱导分化为肝细胞样细胞 和胆管细胞样细胞，具有来源广泛、取材方便、创伤微小、供区隐蔽等优点，该干细胞生长特 性好，可W在体外长期大量扩增，可W满足临床上细胞使用量多的需要。除可用于体内移 植治疗肝病外，还可作为体外生物工程化的类肝器官的构建、体外肝病模型的构建，药物试 验、毒性试验与肝脏功能研究等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种采用人小诞腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和 胆管细胞样细胞的方法及应用。
[0005] -种采用人小诞腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法， 按照如下步骤进行：
[0006] (1)制备人小诞腺上皮干/祖细胞：
[0007]a)预处理人小诞腺组织；
[0008]b)在角质细胞培养基中贴壁培养预处理后的人小诞腺组织，培养分离出小诞腺上 皮干/祖细胞。
[0009] 角质细胞培养基：DMEM/F12添加BSA(牛血清白蛋白）5yg/mL，transferrin(转 铁蛋白）5yg/mL，B阳（牛垂体提取物）50yg/mL，insulin(膜岛素）3. 75g/mL，FGF-2 3ng/ mLEGFIng/mLepinep虹ine(肾上腺素）500ng/血，hy化oco;rtisone(氨化可的松）0. 5g/ 血，ProstaglandinE2 (前列腺素E2) 108MandT3 30nM，lOOU/ml青 / 链霉素。
[0010] C)小诞腺上皮干/祖细胞在上皮细胞培养基中进一培养扩增。
[0011] 上皮细胞培养基：在角质细胞培养基中添加了SiiMCHIR、0. 5iiMA83、为了预防 细胞调亡，在每次传代后第12或24小时内添加0. 5JiM化iazovivin。
[0012] (2)人小诞腺上皮干/祖细胞诱导分化为肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，接种 人小诞腺上皮干/祖细胞于平面培养体系或3D培养体系中，添加含有生长因子的上皮干细 胞成肝诱导培养基，每=天换液，经过21天诱导培养后获得肝细胞样细胞和胆管细胞样细 胞。
[0013] 成肝细胞诱导培养基，在角质细胞培养基中中添加有：2化gmli〇SM，0. 5mMA83， 0.ImMC-E，20ng/ml的HGF，lOng/ml的IGF,IOOnM的地塞米松，lOmmol/L的尼克酷胺。
[0014] 所述上皮干细胞成肝诱导培养基中还可W加入lOOmmol/L的苹果酸，加入后，可 缩短诱导时间。
[0015] 所述预处理人小诞腺组织的步骤为：
[0016] 将小诞腺组织转移到培养皿中，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的 小诞腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约Imm3的碎块。
[0017] 所述预处理切取小诞腺组织的过程中，将组织转移到培养皿中后，还可W向培养 皿中加入小劑提取物培养液，浸泡lOmin，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的 小诞腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约Imm3的碎块。运样处理后的小 诞腺组织在后续贴壁培养过程中，能缩短培养时间。
[0018] 所述的小劑提取物培养液采用如下方法制备：将小劑晒干，磨成粉末，过200筛， 然后加5倍重量的70%乙醇溶液回流提取3次，合并滤液，活性炭脱色，蒸干，得到白色粉末 状物质，采用去离子水配置成质量分数1 %的溶液，制成小劑提取物培养液。
[0019] 所述贴壁培养预处理后的人小诞腺组织的步骤为：
[0020] 用小綴子将人小诞腺组织碎块均匀的铺于培养瓶底部，间距平均5mm，加好培养基 后竖立放于培养箱中，添加5ml角质细胞培养基，6至8小时后放倒培养瓶，使组织块完全 浸在培养液中，=天后首次观察，弃去未贴壁的组织块和液体，重新加入5ml角质细胞培养 基，W后每3天换液一次。
[0021] 所述小诞腺上皮干/祖细胞进一步培养和扩增的步骤为：
[0022] 入小诞腺组织块长出的原代细胞包括碟卵石状或铺路石状的小诞腺上皮干/祖 细胞，当细胞达到70-80%融合时，进行传代，吸走培养瓶中原有培养基，用1XPBS洗涂细 胞2次，吸去PBS，加入，0. 25%膜酶，旋转，使膜酶均匀覆盖培养器皿表面，37°C消化2-3分 钟，显微镜下可见上皮干/祖细胞细胞间隙增大，细胞形态变圆，此时加入含10 %FBS完全 培养基终止消化，再次用吸管吸取液体，轻轻反复3-5次吹打培养器皿表面，使上皮干/祖 细胞彻底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离屯、管中，再向培养瓶中加入1XPBS洗1-2次，并将洗 液一并转移至离屯、管中，2Mg离屯、5分钟，吸去上清液，弃去上清，加入5mL上皮细胞培养基 重悬细胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液，取样计数，接种细胞悬液于培养皿中，之 后细胞每3天更换上皮细胞培养基，第一次按1 : 1传代，之后按1 : 3或1 : 4传代。
[0023] 本发明中的人小诞腺上皮干/祖细胞具有明显的干细胞表现型，通过表面标记流 式鉴定显示CD29、CD49f、CD166和CK-UT(CK14,15,16,19)阳性，免疫巧光和QPCR检测显 示K5、K8、CK15、CK19、LGR5 及LGR6 阳性。
[0024] 本发明提供了培养并诱导小诞腺成体上皮干/祖细胞获得肝细胞样细胞和胆管 细胞样细胞的方法，包括接种小诞腺成体上皮干/祖细胞于平面培养体系和Matrigel3D 培养体系中，添加含生长因子的成肝诱导培养基，经过约21天培养和诱导获得肝细胞样 细胞和胆管细胞样细胞，且具有肝细胞的功能，经免疫巧光检测表达ALB及CYP3A4、CK18、 CK19,QPCR结果显示ALB、AFP、CK18、CYP3A4、CXCR4、S0X17、HNF4 及F0XA2 表达增加，PAS 染色阳性，ICG摄取阳性，细胞色素功能检测阳性。
[00巧]本发明对小诞腺成体上皮干/祖细胞的维持、扩增和传代，及分化诱导为肝细胞 样细胞和胆管细胞样细胞所采用的培养体系、细胞生长因子，维持、扩增和分化的条件有非 常详细的描述。本发明所采用的小诞腺上皮干/祖细胞包括但不仅仅局限于人，也可使用 其它哺乳动物来源细胞。
[0026] 本发明的肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的重要优点之一是可用于自体移植，从 而克服使用异体肝细胞或肝组织移植的缺陷，包括免疫排斥反应和疾病传染。此外，小诞腺 上皮干/祖细胞具有极强的扩增能力，可产生足量细胞，用于疾病治疗。小诞腺上皮干/祖 细胞与肝细胞都是属于同一个胚层，具有很多相似的生物学特性，体外诱导时不需要跨胚 层诱导转化，仅需生物小分子诱导即可形成肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，移植后细胞 在体内的存活、生长和行使功能等有着积极的作用。未经诱导的小诞腺上皮干/祖细胞移 植到肝内后也可转化为表达肝细胞标记的肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。本发明的另一 个优点是人小诞腺组织位置表浅、分布广泛，取材方便，创伤微小，供区隐蔽，可W安全、经 济的得到。小诞腺上皮干/祖细胞取自成人，不存在胚胎干细胞面临的道德和伦理的争议。 本发明所设及的专业术语是本行业内具备普通技能的人±所通常理解的含义。
[0027] 本发明的有益效果：本发明中的小诞腺上皮干/祖细胞取自人小诞腺组织，组织 来源充足，取材方便，创伤微小，供者痛苦微小，取材部位隐蔽，具有很高的成本效益。获得 的小诞腺上皮干/祖细胞体外扩增能力强，可在体外大量扩增。本发明中制备而来的肝细 胞样细胞和胆管细胞样细胞可W用于细胞移植治疗肝病或改善与任何与此类疾病有关的 症状，构建生物工程化的类肝器官，并能作为肝脏模型用于体外相关药物试验与肝脏功能 研究等。
【附图说明】
[0028] 图1为小诞腺组织的原代培养光镜图；
[0029] 图中，左图：40X右图：100X。
[0030] 图2为小诞腺上皮干/祖细胞光镜图100X。
[0031] 图3为小诞腺上皮于/祖细胞生长曲线图。
[0032] 图4为小诞腺上皮干/祖细胞流式细胞分析图。
[0033] 图5为人小诞腺上皮干/祖细胞免疫巧光结果。
[0034] 图6为小诞腺上皮干/祖细胞接种至Matrigel后1天光镜图200X。
[0035] 图7为小诞腺上皮干/祖细胞接种至Matrigel后诱导21天形成肝细胞样细胞球 的光镜图200X。
[0036] 图8为人小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导21天光镜图。
[0037] 图9左图为人小诞腺上皮干/祖细胞3D成肝诱导21天ICG摄取光镜图200X;右 图为3D对照组ICG摄取光镜图200X。
[0038] 图10左