用于细胞维持、扩增和/或分化的透明质酸、其他基质成分、激素和生长因子的复合物的制作方法

专利名称：用于细胞维持、扩增和/或分化的透明质酸、其他基质成分、激素和生长因子的复合物的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及细胞(例如包括肝祖细胞在内的肝细胞)的维持、扩增和/或 分化。更具体地，本发明涉及具有其他细胞外基质成分、激素和生长因子且被用作用于细胞 的维持、扩增和分化的支架的透明质酸(hyaluronan)复合物，所述细胞包括祖细胞亚群， 例如肝干细胞、成肝细胞(h印atoblast)、定向祖细胞以及它们的后代细胞。
背景技术：
先体外后体内的细胞维持取决于营养物、特异性细胞外基质成分的底物以及包括 激素和生长因子的可溶性信号物的混合物的使用。营养物、基质成分和水溶性信号物的独 特的确定成分混合物(defined mixture)诱发细胞的生存、扩增和分化。而且，确定成分混 合物的成分与干细胞(相对于谱系中的过渡细胞(intermediate)且相对于成熟细胞)所 需的特异性成分是谱系依赖性的。以透明质酸复合的混合物提供天然的三维(3-D)信号支 架，该信号支架的坚固性程度除了基础基质分子之外还由交联形式调节，并且该混合物都 为先体外后体内的组织工程和将被再引入至动物(或人)体内的细胞移植物的形式提供相 当大的优势。这些复合物对于干细胞(例如肝干细胞和它们的后代细胞(如成肝细胞和定 向祖细胞))也很有用，所述干细胞可被建立在由确定成分混合物构成的复合物中以诱发 急剧的三维扩增，或者所述干细胞可被接种进驱动三维分化的复合物中。对于包括生物人 工肝或细胞移植在内的基于细胞的疗法而言，干细胞是合乎需要的候选细胞。这种技术应 当有助于所述疗法，尤其是对于实体器官的细胞而言，在实体器官的细胞中，移植方法对于 细胞的体内再引入可能是特别重要的。需要一种实现干细胞的显著扩增的条件。这是由可从正常组织中分离的少数干细 胞来决定的。相反，先体外后体内的组织工程或者细胞疗法的临床程序需要大量的细胞以 达到预期的目标。因此，迫切地需要允许干细胞自身更新和/或大量增殖后继续分化的技 术。

发明内容
在一种实施方式中，本发明提供了一种先体外后体内维持、繁殖和/或分化肝细 胞(包括祖细胞)的方法，该方法包括(a)提供细胞(例如肝祖细胞)的悬浮液；以及(b) 在无血清培养基中并在具有或不具有其他细胞外基质成分以及具有或不具有激素或者生 长因子的透明质酸的复合物上培养细胞，其中基质成分和激素/生长因子的精确混合有利 于细胞群(可为祖细胞或成熟细胞)的1)维持；2)自身复制(也称为自身更新)；3)扩增
5(不包括自身更新)和/或3)分化。祖细胞可以是干细胞(例如，肝干细胞)、短暂扩增细 胞(例如成肝细胞(肝脏的候选短暂扩增细胞))和/或定向(单能)祖细胞(例如定向 肝祖细胞或定向胆祖细胞)。所述细胞外基质可进一步由与胶原蛋白(例如I型、III型、IV型或V型胶原蛋 白)、基底粘附分子(例如层粘连蛋白或纤连蛋白)、蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链(例如 肝素蛋白聚糖或肝素)和/或激素(例如胰岛素)或生长因子(例如表皮生长因子)复合 的透明质酸组成。在某些实施方式中，透明质酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。本发明的细胞是从胎儿组织、新生儿组织、儿童组织或者成人组织中获得的。无 血清培养基可包含胰岛素、转铁蛋白、其他激素(例如三碘甲腺原氨酸、生长激素、胰高血 糖素、皮质醇)、微量元素(例如锌、铜、硒)、生长因子(例如表皮生长因子或EGF、成纤维 细胞生长因子或FGF、白血病抑制因子或LIF)或混合物；并且在某些实施方式中，无血清 培养基可主要由胰岛素、转铁蛋白、脂类和微量元素组成，或者可主要由胰岛素、转铁蛋白 和脂类组成。进一步地，对于上皮细胞而言，在培养基中的钙浓度可以从适于扩增的浓度 (< 0. 5mM)变化至适于分化的浓度(> 0. 5mM)。最后，无血清培养基可不含任何生长因子 或除胰岛素和转铁蛋白之外的任何激素。此外，本发明的透明质酸复合物可用于先体外后体内的组织工程。例如，所述复合 物可被用作移植物的支架而用于体内细胞移植。在本发明的另一种实施方式中，本发明提供一种先体外后体内繁殖干细胞(例如 肝干细胞)或者短暂扩增细胞(例如成肝细胞)或者它们的混合物的方法，该方法包括 (a)提供细胞；以及(b)在无血清培养基中并在与其他细胞外基质成分和/或激素或生长 因子复合的透明质酸中/上培养细胞以繁殖祖细胞群，而不诱导祖细胞群分化为定向祖细 胞。细胞的谱系阶段可按抗原来界定，使得可以利用分化来识别自身更新和扩增。例如，肝 干细胞可以被界定为EpCAM+、NCAM+、白蛋白+、CK19+、密蛋白3+AFP-，而肝脏的可能的短暂 扩增细胞(成肝细胞)是EpCAM+、ICAM-l+、白蛋白+、AFP+、CK19+和密蛋白3_。细胞外基质可以进一步包括与以下物质复合的透明质酸一种或一种以上胶原蛋 白、一种或一种以上基底粘附分子、一种或一种以上蛋白聚糖(或它/它们的糖胺聚糖链) 和一种或一种以上激素或生长因子或它们的混合物。进一步地，在某些实施方式中，透明质 酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。在本发明的又一实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含分离细胞的细胞培 养物、无血清培养基以及与或未与其他成分复合的透明质酸。细胞外基质成分进一步包 含多种胶原蛋白的任何一种，基底粘附分子和/或蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链的任何一 种。同样，在某些实施方式中，透明质酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。在另一种实施方式中，透明质酸复合物被接种了上皮细胞(例如肝实质细胞)和 某些间质细胞(例如内皮细胞)的混合物，并且被用作支架而用于体内细胞移植。


本专利文件或申请文件包括多幅彩色附图。一旦请求并支付必要的费用，专利局 即提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。图1是显示肝祖细胞上的透明质酸受体的图片。图1A显示出了培养塑料上与间质伴胞结合的人肝祖细胞上的透明质酸受体，并且透明质酸受体CD44(绿色)和Dapi (蓝 色)被染色。(10X)。图1B-1D是新鲜分离的肝祖细胞的图像，图中显示出CD44(绿色)和 AFP (红色)。(60x)。图中B代表⑶44、C代表AFP、D代表重叠。图1E是在肝干细胞集落 上透明质酸受体表达与相结合的间质伴胞相比较的对比图片。平板以Bodipy共轭的透明 质酸染色。(4X)。图1F-1I是显示存在于培养塑料上的各种不同细胞类型的复合图像。人 肝干细胞的集落中的DNA(Dapi-蓝色)或EpCAM(绿色)被染色。肝星状细胞表达结蛋白 以红色表示。(40x油)。图中A代表DAPI、B代表EpCAM、C代表结蛋白、D代表重叠。图2显示接种在透明质酸水凝胶中细胞的生长能力。图2A和2B是接种有人成 肝细胞的透明质酸水凝胶与培养了 20天的透明质酸水凝胶的相差图像。(20X)。图2C 显示在透明质酸水凝胶中培养11天随后用溶酶体荧光探针Lysotracker (绿色；488nm) 和线粒体荧光探针Mitotracker (红色；543nm)染色(以显示细胞的生存能力)的人肝 祖细胞的集合体(球状体)。所示的图像是以40x/1.30il DIC的球状体的共聚焦切片， 缩放比例为0.06 iim x0. 06umo图2D是通过球状体的共聚焦切片，显示在培养第11天 时的透明质酸水凝胶内球状体核心内的细胞的生存能力。从画面1开始至画面6结束， 图像“切开”球状体，显示中心处的活细胞。堆叠尺寸(stack size) =1024x1024x45, 921. 4iimx921. 4iimxl32. Oiim。缩放比例0. 9 ii mxO. 9 ii mx3. 0 ii m。物镜平面-萤石物镜 10x/0. 3。波长543nm(Zeiss 510)。图3显示在透明质酸水凝胶中培养的人成肝细胞的某些抗原表达。在透明质 酸水凝胶中培养的人成肝细胞的集合体的各种标记物被染色。所有的照片都是在Zeiss 510 (Leica和Olympus Flow View共聚焦显微镜)下拍摄的。图3A显示细胞角蛋白 19(CK19)的表达。波长488nm。40X物镜/l. 30il DIC。使用的缩放比例为0. llumxO. llum0 图3B是透明质酸水凝胶中的肝祖细胞球状体的相显微照片，使用40X物镜/1.30il DIC。图 3C是图3A和图3B的重叠图像。图3D显示与图3B中的相同的球状体细胞培养物中的白蛋白 表达。物镜平面-萤石物镜40x/l. 30il DIC。波长543nm。堆叠尺寸230. 3 u mx230. 3 u m0 缩放比例AJZiimxOJZiim。在透明质酸水凝胶内的人成肝细胞中白蛋白的表达以红色 显示。图3E是水凝胶内的成肝细胞的相显微照片。图3F是图3D和图3E的重叠图像。图 3G显示出了细胞角蛋白(CK)8和18的表达(绿色；Alexa 488)。细胞核用Dapi (蓝色) 染色。透明质酸水凝胶没有被染色并在背景中显现为“波纹状”图像。使用60x油浸镜头 (Leica)。图3H显示透明质酸水凝胶内细胞球状体内细胞中的I-CAM/1的表达(Alexa 488 ； 绿色)。细胞核用DAPI (蓝色)染色。60x油浸镜头(Leica)。图31-图3L显示被维持在水 凝胶培养物中的细胞中的EpCAM、AFP和白蛋白的表达。20x和6x可变焦距镜头。(Olympus FV500)。图31. DIC(黑白)。图3J. EpCAM(绿色)。图3K. AFP(红色)，20x和6x可变焦距 镜头。图3L白蛋白(黄色)。20x和6x可变焦距镜头。图4显示在透明质酸(HA)水凝胶中培养的成肝细胞合成白蛋白和尿素的证据。 图4A显示在30天的培养期内所测量的、与在塑料基底上的细胞白蛋白产量相比较的、在HA 凝胶中的细胞白蛋白产量。被涂覆在HA水凝胶中的肝祖细胞的标准化白蛋白产量(开放 色码环)在收集的培养物中调节并且可见到在第8天和第9天后白蛋白产量峰值下降(黄 色)。塑料条件下培养的白蛋白数据(封闭填充环)被显示在水凝胶条件的白蛋白数据下 方，所有的点都低于水凝胶条件所检测到的白蛋白浓度的最低值。没有数据线条适合于白蛋白产量。图4B显示相对于其他底物在HA水凝胶中细胞中的尿素产量。将由在透明质酸 水凝胶中的肝祖细胞产生的标准化尿素产量mg/dl (开放倒三角)与塑料培养物(闭环)、 I型胶原蛋白凝胶培养物(开环)或胶原蛋白夹心式凝胶培养物(已填充的三角)培养物 相比较。增加点对点曲线使得所图示点的天对天观察(following)更容易。图5显示CK19、白蛋白和AFP的RNA表达(以GAPDH标准化)。编码CK19 (A)、白 蛋白(B)和AFP(C)的RNA被从新鲜分离的成肝细胞的培养物、肝干细胞和在HA水凝胶中 培养的肝祖细胞中分离。所有的值都以管家基因GAPDH标准化并以样品总RNA的每30ng 中存在的链数表达。图6显示被从塑料中挑出并被转移或传递至透明质酸水凝胶的表面的肝干细胞 集落，该透明质酸水凝胶通过二硫桥交联，具有或不具有相关的胶原蛋白。A.透明质酸水凝胶B.具有I型胶原蛋白的透明质酸水凝胶C.具有III型胶原蛋白的透明质酸水凝胶D.具有IV型胶原蛋白的透明质酸水凝胶图7显示被从组织培养塑料上的培养物中挑出并被转移至透明质酸水凝胶表面 的肝干细胞集落，该透明质酸水凝胶通过二硫桥交联并与下述成分复合A.层粘连蛋白B.与I型胶原蛋白混合的层粘连蛋白图8显示被嵌入在由二硫桥交联的透明质酸水凝胶中的肝干细胞。要注意的是， 所述细胞正在水凝胶各处形成集合体或者球状体。A.具有嵌入的肝干细胞的透明质酸水凝胶。4XB.具有嵌入的肝干细胞的透明质酸水凝胶。20X
具体实施例方式在体内，肝细胞与可溶性因子(例如营养物、气体、生长因子)和非可溶性因子 (例如细胞外基质成分)都发生相互作用。与这些因子的相互作用-特别是细胞与细胞之 间的相互作用、生长因子的有效性以及在成熟肝脏组织中发现的特异性细胞外基质成分的 存在与否_已经被研究。然而，主要在胚胎和胎儿组织中发现的基质化学物质的效果较少 被研究。透明质酸(HA)是由二糖单元组成的糖胺聚糖(GAG)，二糖单元之间分别通过N-乙 酰基-D-葡萄糖胺部分与葡萄糖醛酸部分之间的3-1-3键、3-1-4键连接。透明质酸有 助于基质结构的稳定性和完整性、水和蛋白质的动态平衡、组织保护、分离和润滑、细胞移 动/迁移的促进、运送调节(包括空间排阻)、作为储藏器而锚定激素以及免疫炎症响应的整合。在胚胎组织中和在经历细胞扩增和增殖、创伤修复和再生的成人组织中，发现大 量的透明质酸。在肝脏中，透明质酸存在于胚胎和胎儿组织的基质中并且靠近位于成人肝 脏的1区的预定(presumptive)干细胞区室(赫林氏管)。然而，相信透明质酸不与成熟的 实质细胞结合。因此，本发明的发明人推测，透明质酸可以是候选的基质成分，作为用于细 胞(特别是祖细胞)的先体外后体内的培养的3-D支架，或作为用于将细胞再引入宿主的 移植物的支架。
8换率，且得到的支架易碎且不稳定，影响了它们在以下 实际应用方面用到的能力先体外后体内培养、组织工程、生物反应器体系或移植使用的移 植物。因此，本发明的透明质酸支架通过化学交联被“稳定”。在某些实施方式中，透明质酸 通过醛桥被交联，而在其他实施方式中，透明质酸通过二硫桥被交联。发明人测试了通过交联而被化学修饰的透明质酸的生物学效果，交联使得透明质 酸水凝胶支架不溶于水，但保持了被预期为它们的生物学功能所必须的性质。被接种到透 明质酸水凝胶中的人成肝细胞被发现保留其生存能力和分裂能力超过四周，比在培养塑料 上的细胞可能具有的时间长3倍。我们惊奇地发现，被接种到纯透明质酸(没有与其他成分 复合)中的细胞在培养基(Kubota氏培养基，为干细胞/祖细胞而设计，仅由基础培养基、 胰岛素、转铁蛋白/Fe、脂类和两种微量元素(硒、锌)组成)中保持稳定(即，不分化)，并 且在整个培养期内保持如干细胞或者非常早期的成肝细胞。虽然，其他培养条件对于肝干 细胞的生存和自身复制是允许的(例如III型胶原蛋白和Kubota氏培养基)，但透明质酸 已经是被发现的有利于干细胞和成肝细胞的生存和自身复制的第一培养条件，并且是允许 以三维形式维持和自身复制的第一培养条件。在单层形式中，成肝细胞的生存需要各种养 料，并且成肝细胞表现出在迄今已发现的养料上的有限扩增潜能；实际上，已发现成肝细胞 仅在透明质酸上自身复制，且不在所测试的其他条件下自身复制。肝脏是由造血细胞、间质细胞和肝祖细胞的混合物构成的。肝脏中的肝祖细胞亚 群由两个多能细胞群(肝干细胞和成肝细胞)和两个单能细胞群(定向肝祖细胞和定向胆 祖细胞)组成。肝干细胞和成肝细胞在以下方面具有大量相同点它们的表型；表达白蛋白、 上皮特异性细胞角蛋白(CK)8和18、胆特异性细胞角蛋白CK19、上皮细胞粘附分子 EpCAM(CD326或HEA125)、CD133/1 (Prominin)、端粒酶、Shh蛋白和Ihh蛋白；并且对于造血 蛋白(⑶45、⑶34、⑶38、⑶14和血型糖蛋白A)、内皮细胞(⑶31、VEGFr或KDR、血管性血友 病因子)以及其他间质蛋白(⑶146、结蛋白、a-平滑肌肌蛋白或SMA)标记物呈阴性。它 们可在以下方面区别开来，肝干细胞表达NCAM和密蛋白3，而成肝细胞表达ICAM-1(CD54)、 甲胎蛋白(AFP)和胎儿P450(例如P450A7)(见表1)。在体内，多能肝祖细胞在妊娠的第 11周到第13周之间产生肝谱系和胆谱系。
EpCAM =上皮细胞粘附分子；CK19 =细胞角蛋白19、胆特异性细胞角蛋白；I-CAM =细胞间粘附分子；NCAM =神经元细胞粘附分子；MDR3 =多药耐药基因同种型3 (在胆汁
输运中涉及到)；P450-C3A4 =细胞色素P4503A4 ；密蛋白3 =紧密结合蛋白(同种型3)， n. t =未测试。
本发明提供了一种在长时间内维持、扩增和/或分化包括祖细胞在内的细胞的方 法。该细胞可以在生存条件、扩增条件或分化条件下被建立，所述条件依赖于与透明质酸 复合的成分的精确混合物以及无血清成分确定培养基的确切成分。在一种实施方式中，肝 祖细胞、成肝细胞或肝干细胞是从人的肝脏中获得的，并且在具有“Hiroshi Kubota氏培 养基” (HK)的透明质酸水凝胶上/中繁殖，该Hiroshi Kubota氏培养基是无血清基础培养 基，其具有低浓度的铜或没有铜和具有低浓度的钙(< 0. 5mM)，且仅补充有胰岛素、转铁蛋 白/Fe、脂类(高密度脂蛋白和与纯化白蛋白结合的游离脂肪酸)以及某些微量元素(锌、 硒)。该方法还提供用于具有特定表型的细胞的稳定繁殖的装置，该表型在这些条件下介 于干细胞表型和成肝细胞表型之间。这样，与为肝祖细胞而调节的无血清培养基(例如，HK 培养基)结合的透明质酸水凝胶可为人肝祖细胞(在这种情况下，为干细胞和早期的成肝 细胞)提供合适的三维支架。水凝胶加上培养基也能够在生存能力方面使得细胞(例如早 期的成肝细胞)的维持具有繁殖能力、在延长的培养期中具有表型稳定性，并且对于向胆 细胞或肝细胞的转变具有最小的谱系限制(如果有的话)。不坚持理论或不受理论的约束，目前认为，经醛交联(例如，通过HA的羧酸基团) 的透明质酸很少被来自肝干细胞的伴胞(例如成血管细胞或内皮细胞)中的酶活性修饰， 并且导致HA上的肝祖细胞生长缓慢。细胞外基质的转换，包括透明质酸的转换，通常通过 细胞的酶解而在体内完成，酶解是在细胞的扩增和建立中形成组织或器官的固有过程。因 此，目前认为先体外后体内的祖细胞需要为了扩增而分解透明质酸的能力。如同包含在水 凝胶中的大流体体积可影响细胞的成熟一样，HA支架的硬度也可影响细胞的成熟。因此， 应当调节HA水凝胶的物化性质(例如柔韧性和交联密度)以优化细胞扩增的过程。实施例人肝脏的来源胎儿肝脏。肝脏组织由官方认可的机构(Advanced Biological Resources, San Francisco, CA)提供，所述肝脏组织是从受孕18至22周之间任选的时间停止妊娠的胎儿 中得到的。研究方案经UNC的人类研究伦理委员会的审核和批准。新生儿肝脏。来自新生儿、儿童和成人捐献者的完整肝脏是经UN0S通过器官捐献 计划获得的。用于这些研究的肝脏被认为是正常的，没有疾病过程的迹象。以研究为目的 的肝脏的使用获得了直系亲属的知情同意，方案得到人类研究伦理委员会的批准，并且处 理遵从GMP。细胞分离胎儿肝脏。处理人胎儿肝脏组织的方法先前已在例如Schmelzer E等2006 (Stem Cells)中被报道。所有处理过程和细胞富集过程都在细胞清洗缓冲液中进行，该细胞清洗 缓冲液由补充了 0. 牛血清白蛋白(BSA Fraction V,0. 1 %，Sigma，St. Louis，Mo.)、浓度 均为g/ml的胰岛素和铁饱和转铁蛋白(Sigma St. Louis,M0)、微量元素(亚硒酸，300pM 和硫酸锌，50pM)以及抗生素(AAS，Gibco BRL/Invitrogen 公司，Carlsbad，California) 的基础培养基(RPMI 1640)组成。将肝脏组织再分为3mL的片段(总体积范围为2mL至 12mL)，用于在25mL的、32EC的含有IV型胶原蛋白和脱氧核糖核酸酶(SigmaChemical Co.， St.L0UisJ^*6mg/mL)的细胞清洗缓冲液中分解，并在15-20分钟的时间内频繁搅拌。这 导致产生细胞集合体的均勻悬浮液，将细胞集合体通过40针(gauge)的网孔，并且在重新悬浮于细胞清洗溶液之前，以1200RPM离心旋转五分钟。红细胞通过低速离心被分离，或者 通过以下方式被分离使用抗人红血球(RBC)抗体(Rockland，109-4139号)(1 5000稀 释液)处理悬浮液15分钟，再使用LowTox Guinea Pig补体(Cedarlane Labs，CL4051号) (1 3000稀释液)处理10分钟(均在37°C进行)。通过台盼蓝排除法估计的细胞生存能 力通常高于95%。进一步的详细信息参见补充数据。新生儿肝脏。在34°C，通过门静脉和肝动脉向所述肝脏灌注含有EGTA的缓冲液15 分钟，然后灌注600mg/L的胶原酶(Sigam)30分钟。器官在任一种收集缓冲液中被机械解 离；将细胞悬浮液通过孔径为1000微米、500微米以及150微米的过滤器；收集单个细胞， 随后在Cobe2991细胞洗涤器中，使用在Optipr印-补充缓冲液中的密度梯度离心(500xg， 室温，15分钟)从死亡细胞和碎片中分离活细胞。收集所产生的位于OptiPr印/细胞溶液 和不含酚红的RPMI-1640之间的界面处的肝细胞带。在其他实验中，使用几种活体染料中的一种来评价培养基中的生存能力，该活体 染料包括溶酶体绿色荧光探针Lysotracker Green、线粒体红色荧光探针Mitotracker Red和溶酶体红色荧光探针Lysotracker Red (Molecular Probes)。优选地，当共同染色时， 基于与其他荧光探针的差别选择染料。活体染料在HK培养基中培育30分钟并且浓度如 下溶酶体绿色荧光探针LysotrackerGreen 75nM、溶酶体红色荧光探针Lysotracker Red 75nM以及线粒体红色荧光探针Mitotracker Red250nM。组织培养塑料被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液被接种在塑料上，其中2. 5%胎牛血 清(FBS)被添加至HK培养基中。在37°C、含有5% C02条件下培育16小时后，用无血清HK 培养基代替之前的培养基，以用于后续研究。塑料上的细胞以每3天更换一次培养基的方 式培养，直到实验结束。在最开始的16小时培养过程中没有贴附的细胞在更换培养基时被 吸出。在试验结束时，在吸出HK培养基后，将4%的多聚甲醛加至平板上以固定细胞。使用以相关荧光探针直接标记的一抗或者使用两步染色法(先用一抗染色，接着 用与荧光探针结合的二抗染色)来给细胞染色，以用于免疫荧光检测(见下表2)。染色之 前，将大约lmL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)置于需要的地方以洗去任何碎片。在1小时内加入 山羊血清(在磷酸盐缓冲溶液中，浓度为10%)以封闭组织内的非特异性结合位点。移除 封闭并且用lx PBS清洗位点。加入单克隆抗体并且培育过夜。4°C培育过夜(例如18小 时)后，移除一抗单克隆抗体溶液，并且用lx PBS冲洗样品三次，每次10分钟。以1 750 或 1 1000 的稀释比例加入二抗(Alexa 488 或 Alexa 594，Molecular Probes)。覆盖 样品以避光，并让其在室温条件下培育1小时。用lx PBS冲洗样品3次，并且使用用于显 微镜检术的DPX封固剂(Electron Microscopy Science)或者含有DAPI封固剂的Vector Shield (Vector Laboratories)来用盖玻片制备样品。DAPI的浓度为1.5iig/ml。在培养液中培养10天后，使用在PBS中的4 %多 聚甲醛将胎儿的肝干细胞集落固定，并且在室温下使用在PBS 1 % Triton-XlOO中的 10%山羊血清来封闭该细胞集落1小时。一抗(兔IgG抗结蛋白(Abeam)和鼠IgGl抗 EpCAM(Labvision))被用于在室温条件下封闭缓冲液1小时；二抗(抗-兔AlexaFluor568、 共轭的抗-鼠 IgGlAlexaFluor488(MolecularProbes/Invitrogen))以及用于细胞核染色
12的DAPI(Sigma)被用于在室温条件下封闭缓冲液1小时。使用由Leica SP2TCS软件控制 的Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜(Leica Microsystems)分析荧光。为了分析与荧光探针标记结合的细胞质抗原(例如白蛋白，AFP)，使用Leica SP2A0BS立式激光扫描共聚焦显微镜、Zeiss 510Meta反向激光扫描共聚焦显微镜和Leica DMIRB反向荧光/DIC显微镜(配有B/W和彩色数码相机)来使细胞成像。
结果表明，如图1A所示，人肝干细胞和成肝细胞对于透明质酸受体呈阳性，该结 果通过使用抗CD44的荧光抗体来免疫染色人肝干细胞的紧密结块的25日龄集落来证实。 呈AFP阳性的新鲜分离的成肝细胞也对⑶44受体呈阳性(图1B-图1D)。⑶44 (细胞表面 糖蛋白)被显示为绿色，它标记出了用于HA附着的受体。在图1A中，受体覆盖干细胞集落 中几乎100 %的细胞，单个细胞含有不同量的受体，可见在某些细胞中染色深，而其他细胞 较明亮，染色较浅。通过使用DAPI染色(蓝色)细胞核，使单个细胞相互间形成对比。如图所示，染色暗示了每个人肝祖细胞具有HA附着能力。在图1E中，从人类 胎儿肝脏中分离并在塑料上培养4周的人肝祖细胞的原代培养物被以4x成像，并且以 HA-B0DIPY共轭物荧光染色。肝祖细胞表达HA受体水平的速度比培养物中的其他细胞(包 括基质细胞和内皮细胞)快。由于摄入共轭的HA而具有大量B0DIPY染色的肝祖细胞位于 左下象限。相比较而言，分别出现在右下象限和上象限的成纤维细胞和非实质细胞在它们的 HA介导的结合和摄取中活性较小。已利用以其他限定的标记物来进行非实质细胞的免疫组 化染色，以识别特异性亚群。间质细胞包含多个亚群，包括成血管细胞(KDR+/⑶133-1+/ ⑶117+)；成熟内皮细胞(⑶31+)；肝星形细胞(结蛋白+，a-平滑肌肌蛋白+)；包括红血 球细胞(血型糖蛋白A+)在内的造血细胞(⑶45+)。这些细胞亚群的代表如图1F-图II所 示(对于结蛋白的表达呈阳性的肝星形细胞位于邻近EpCAM阳性干细胞的位置)。胞甚HA越碰肿丽馳曰三鮮J曾透明质酸(平均分子量1，500，000)从Kraeber GMBH and Co. (ffaldhofstr, Germany)获得。己二酸二酰胼(ADH)和乙基_3_[3_ 二甲基氨基]丙基碳二亚胺(EDCI) WSigma-AldriCh(St.L0uiS，MO)购买。本文公开的这些试剂和其他试剂可从多个卖方 获得，所有这些卖方都提供适用于本发明实施的试剂。用于细胞培养的透明质酸基质是 使用先前已公开方案的一种修饰方法通过醛交联而制备的。参见，例如，Vercruysse KP 等，Synthesis and In Vitro Degradationof New Polyvalent Hydrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid(与透明质酸水凝胶交联的新型多价酰胼的合成和体内 降角军) Bioconjugate Chemistryl997 ;8 :686_694 ；禾口 Kim A.等，Characterization of DNA-hyaluronan matrix forsustained gene transfer (用于持续基因转移的 DNA_透明质 酸基质的性质).Journal of Controlled Release 2003 ;90 :81_95 ；通过引用将它们的公 开内容全部并入本文。简言之，制备、测量并在适当尺寸的铝模具中沉积的透明质酸水溶液，干冰上 速冻并且冻干以形成固态海绵状薄片。将该薄片在0. ADH溶液(90%异丙醇/10%水) 中培育30分钟以使ADH溶液能够完全渗透。将EDCI (120mg)加入到ADH溶液中并通过搅 拌快速溶解。通过向试剂混合物中加入IN HC1以调节pH至约为4. 5来开始部分水合的HA 海绵状薄片的交联。通过倾析试剂混合物并且以100ml的90%异丙醇替代它来终止反应。随后，通过 培育过夜而使用100ml的90%异丙醇连续萃取回收的已交联HA基质至少五次。然后将HA 基质转移至纯的异丙醇中以除去所有的残留水分并风干。已交联的HA基质的直径分别为 0. 7cm或3. 5cm。当再次水合时，HA基质易于吸收水分并且形成高度多孔的HA海绵状水凝 胶。在用于培养之前，通过具有40Gray (40焦耳/kg)的递送剂量的铯源(JL Shepard Mark1Model 68CesiumIrradiator-Department of Radiation Oncology,UNC) JM身寸 10 中白勺 时间而给HA水凝胶灭菌。在诱明质酸水凝胶中的成肝细胞培养物HA水凝胶被置入培养孔中，该培养孔是由聚苯乙烯制成的6孔培养板的培 养孔，或者对于尺寸较小的水凝胶基质而言，该培养孔是腔室盖玻片培养片的培养孔 (Lab-Tek-Nunc, Napersville, IL)。较小的水凝胶在接种新鲜分离的细胞前，除了用HK培 养基预浸泡之外，不需要操作(引发)。轻微的操作有利于较大的水凝胶，以确保从水凝胶 中移除气泡。在大多数情况下，在水凝胶上添加3ml的HK培养基可以捕获气泡，通过轻轻 挤压水凝胶驱使空气从侧面排出而可使气泡被机械地移除。引发后，被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液以2X106个细胞/水凝胶和
2X 105个细胞/小水凝胶的密度被接种于在含有2. 5 % FBS的HK培养基中的大HA水凝胶 上。在C02恒温箱中，37°C条件下，16个小时的最初培育后，含有FBS的培养基被无血清HK 培养基代替。6孔平板的工作体积为3ml并且2-腔孔的工作体积为2ml。细胞在这些相同 条件下培养4周，每2-3天更换一次培养基。如本文所讨论的，HK培养基由无血清基础培养基(例如，RPMI 1640， Gibco-Invitrogen)构成，该无血清基础培养基不含铜，且含有低钙浓度(< 0. 5mM)并且补 充有胰岛素(5y g/ml)、转铁蛋白/Fe(5iig/ml)、高密度脂蛋白(10iig/ml)、硒(10-10M)、 锌(10-12M)和7.6PE与纯化的白蛋白结合的游离脂肪酸的混合物。这种培养基的具 体制备方法己在别处公开，例如，Kubota H, Reid LM. Clonogenic hepatoblasts, common precursors forhepatocytic and biliary lineages, are lacking classical maj or histocompatibilitycomplex class I antigen(产克隆成肝细胞，肝谱系和胆谱系的 共同前体，缺少典型的主要组织相容性复合物I类抗原).Proceeding ofthe National Academyof Science (USA) 2000 ；97 :12132_12137 ；通过引用将其公开内容全部并入本文。从新鲜分离的人胎儿肝脏中分离的细胞在水凝胶中展现出对聚集/扩增的亲和 性。单个细胞和最多具有四个细胞/集合体的集合体首先被接种在HA水凝胶内。在3周 的培养期结束时，图2A、图2B、图2C和图2D所示的细胞集合体展现出更大的细胞集合体。 图2B中的抽样集合体具有的细胞计数为每个集合体有63到2595个细胞。图2A和图2B 图示了在HA水凝胶中的可见集合球状体。而且，图2C和图2D中的集合体利用线粒体荧光探针Mitotracker活性和溶酶体 荧光探针Lysotracker活性的荧光捕获展示了细胞的生存能力，其中荧光探针在主动吸收 后穿入可见组分中。图2D也表示共聚焦平面，它显示出集合球状体的内部(线粒体红色荧 光探针Mitotracker-red，被染色的)结构2_5内不是中空的也不是坏死的。DNA测量显示 出从塑料上的死亡细胞中收集的可计量细胞DNA的完全逆转，与它们在HA水凝胶中的扩增 (在14天的培育期内，平均每天增加量为约2% )相对。与在培养塑料上的成肝细胞相比较，在透明质酸水凝胶中的成肝细胞存活时间较 i被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液被接种在塑料上，其中2. 5%胎牛血 清(FBS)被添加至HK培养基中。在37°C、含有5% C02条件下培育16小时后，用无血清HK 培养基代替之前的培养基，以用于后续研究。塑料上的细胞以每3天更换一次培养基的方式培养，直到实验结束。在最开始的16小时培养过程中没有贴附的细胞在更换培养基时被 吸出。在试验结束时，用4%的多聚甲醛固定细胞。在水凝胶中和在HK培养基中的细胞，在大于4周的整个培养过程中，维持一种介 于肝干细胞表型和成肝细胞表型之间的稳定表型，且对于向胆细胞或肝细胞的转变没有谱 系限制。代表性的数据由在图3中给出的免疫组化染色而显示。通过胆谱系标记(CK19) 与白蛋白的共同表达可证实细胞是肝实质祖细胞(图3A-3F)，通过CK8/18染色可证实细胞 是上皮细胞(图3G)。在大多数细胞中发现的I-CAM染色(图3H)以及AFP的低水平表达 表明细胞处于接近成肝细胞分化阶段的分化阶段。实际上，完全分化的成肝细胞被预期具 有高水平的甲胎蛋白，这是通过生化功能试验证实的一种结论(见下文)。最后，成肝细胞 由EpCAM、AFP和白蛋白这三种标记的共同表达来标记(图31-图3L)。& HA越碰^ M胞燃■成,隨胞纖職〒_白蛋白的产量由酶联免疫吸附试验(ELISA)测试。在4周的培养期内，每天或每隔 一天从对照(塑料)培养物和HA水凝胶中收集一次培养上清液。来自培养物的培养基被 冷冻并被保存在零下20°C，直到被分析。纯化的人白蛋白被作为标准，过氧化物酶共轭的抗 体被用作抗白蛋白的荧光探针。使用Spectromax 250多孔板读数器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)进行测量。相似地，基于尿素与二乙酰肟的直接相互作用，尿素产量采用尿素氮敏感试验来 分析。使用细胞荧光Spectromax 250多孔板读数器，在515nm-540nm处，以分光光度法测 量尿素浓度。在30天的培养过程中，将在HA水凝胶中培养的肝祖细胞的白蛋白的产量与 在塑料上培养的肝祖细胞的白蛋白的产量相比较。对于所有的培养物而言，在第7至第10 天之间，白蛋白的浓度(每体积)达到峰值。成肝细胞在塑料上的培养物中维持7至10天 并且可靠地表达相当高水平的白蛋白。相反，肝祖细胞在水凝胶中的培养物中维持大于四 周的时间。图4A是涂覆在HA水凝胶中的成肝细胞的标准化白蛋白产量(开放色码环)。白蛋 白的水平在第8至第10天之间达到峰值并下降，类似于涂覆在培养塑料上和I型胶原蛋白 衬底上的细胞的白蛋白水平变化。标准化的白蛋白数量显著偏高，调节出接近4X10-5mg/ ml的趋势，然而在塑料上培养的成肝细胞完全低于基线2. 5X 10-5mg/ml。当相对水凝胶中 细胞的白蛋白数据绘制塑料上细胞的白蛋白数据时(封闭填充环)，标准化的数据一向低 于在HA水凝胶中培养的相同的细胞。当在本研究中使用胶原蛋白凝胶时，使用鼠尾I型胶原蛋白。除非另有说明，否则 胶原蛋白基质的密度浓度为1. 5mg/ml。对于本研究的平皿培养法而言，0. 4ml的I型胶原 蛋白被涂覆在直径为35mm的培养皿表面上，并且在37°C、95% 02-5% C02条件下培育1小 时以允许凝胶化。然后，使用补充有10% FBS的培养基将1百万活肝细胞接种在凝胶层上。 细胞培育8小时之后，除去培养基并将0. 5ml的无血清培养基加到所述培养物的上层，并且 每天更换。对于本研究的夹心式培养研究而言，培养使用35mm组织培养皿。简言之，将1百万 活细胞涂覆在平板胶原蛋白基质上并且允许在补充了 10% FBS的培养基中，37°C和5% C02 条件下，附着8小时。然后，除去培养基并且添加额外的0.4ml的胶原蛋白在细胞的上层， 接着在37°C条件下，凝胶化1小时。随后，将0. 5ml的无血清培养基加到培养物的上层，并且每天更换。尿素生产(成熟肝细胞的共同功能)在图4B中被图示。对该试验而言，尿素的浓 度以mg/dl形式给出。由在透明质酸水凝胶中的成肝细胞产生的标准化尿素产量mg/dl (开 放倒三角)与塑料上的细胞的标准化尿素产量mg/dl (闭环)、单层I型胶原蛋白培养基上 的细胞的标准化尿素产量mg/dl (开环)以及在两层I型胶原蛋白之间培养的细胞的标准 化尿素产量mg/dl相比较(混杂填充三角)。同样，在所有培养物中的尿素产量都有降低， HA水凝胶比塑料表现得稍微好些，并形成较缓慢的下降衰减。在HA水凝胶中培养的细胞的RNA分离是使用Invitrogen提供的TRIzol分离试 剂来完成的。从培养板中移除水凝胶并将水凝胶放入2ml的Eppendorf管中，在4°C条件 下，在微超速离心机上以12，000rcf(ll，953.34g)的速度离心。通过抽吸移除上清液并且 加入lml TRIzol。在对比性的塑料对照培养物(其中细胞贴附在培养平板上)中，TRIzol 被直接加到平板上，然后被收集至管内(不需要离心，但在抽吸培养基之后)。通过添加0. 2ml氯仿，经相分离而收集RNA。收集水相之后，通过异丙醇沉淀RNA， 接着用70%的乙醇洗涤。最终的RNA沉淀被风干，并被重悬在100 yl的无RNA酶的水中。 使用DU7400分光光度计(Becker)完成定量。通过向每个残留TRIzol试剂的管中加入0. 3ml的100%乙醇来分离DNA。试管在 室温培育两分钟，然后以1000g在4°C条件下离心5分钟。苯酚/乙醇水相被除去以用于蛋 白质的进一步分析。用柠檬酸钠溶液洗涤DNA粒两遍，然后用75%乙醇洗涤DNA粒两遍， 并且每次以5000g在4°C离心。第二次用乙醇洗涤离心之后，通过抽吸移除上清液，并且将 样品风干15分钟。将DNA粒在100 ill的8mM氢氧化钠溶液中重新溶解，并且使用3. 2 yl 1M Hepes(Mediatech)来缓冲液处理，最后达到pH为7. 0。样品以12000g离心10分钟，并 将上清液转移至新的管中。使用Beckman分光光度计完成DNA定量。通过定量实时RT-PCR分析的基因表达基因特异性mRNA通过以下方法产生使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia, CA)从肝脏中提取总RNA，并通过Superscript II型逆转录酶(Invitrogen)和寡脱氧胸 苷(12-18)引物逆转录总RNA。在传统的PCR中，cDNA作为模板与基因特异性引物(序列 见下表3) —起被使用，在该基因特异性引物中，正向引物具有用于T7启动子序列(5’ gac teg taa tac gac tea eta taggg)的5，突出端。该扩增的基因特异性DNA与T7-RNA聚 合酶(Promega) —起被用于体外转录，产生在定量RT-PCR(使用不具有5’突出端的基因特 异性引物)中用作标准物的基因特异性RNA(具有被T7-RNA聚合酶包括的额外的5’ ggg) 被作为标准使用；标准范围为1个模板至108个模板。使用LightCyclerRNA Master SYBR Green I型试剂盒在LightCycler仪器(Roche)中完成定量RT-PCR。使用RNeasy小型试 剂盒(Qiagen)从样品中提取RNA。图5A-图5C是CK19水平、白蛋白水平和AFP RNA水平的图表比较，这些水平以在 HA水凝胶中培养的肝祖细胞中的GAPDH管家基因、在塑料上培养的肝干细胞中的GAPDH管 家基因以及从胎儿肝细胞悬浮液中新鲜分离的成肝细胞中的GAPDH管家基因的水平被标 准化。对于来自新鲜分离的成肝细胞的每30ng总RNA而言，具有高水平的AFP (130链)、白 蛋白(7000链)以及相对低水平的CK19(1.2链)。相反，从肝干细胞中分离的RNA中根本 没有AFP，且显示出低水平的白蛋白(2. 6链)和高水平的CK19(100链)。被接种植在HA水
17凝胶中的肝祖细胞显示出低水平的CK19 (1. 66链)、低水平但是可检测的AFP (0. 33链)以
及一定水平的白蛋白(5. 77链)，该白蛋白水平高于肝干细胞中的白蛋白水平，但显著低于
在新鲜分离的成肝细胞中观察到的白蛋白水平。在HA水凝胶中维持的肝干细胞或肝祖细
胞中都没有检测到Cyp3A (在成熟的肝细胞中发现的P450细胞色素)。因此，HA水凝胶中
的肝祖细胞不是干细胞，因为它们表达AFP和ICAM-1，但是与新鲜分离的成肝细胞相比较，
它们的功能定量水平更接近干细胞。事实上，这些细胞是早期的成肝细胞。
表3. RT-PCR分析中使用的引物序列 *如在美国专利申请第20030148329号所报道的，AFP引物是仅检测肝特异性AFP 的引物，通过引用将该专利申请的公开内容全部并入本文。虽然本发明已经描述了与其相关的具体实施方式
，将被理解的是，本发明能够被 修改并且本发明目的是覆盖任何变化、用途或者本发明的后续修改。总体上，本发明的原则 和对本发明公开的内容作的变更(如在本发明所属的技术领域的公知或惯例范围内作的 变更以及在可能被应用的必要特征上作的变更)在上文中已阐述，权利要求的保护范围如 下所述。
权利要求
一种在三维(3-D)条件下先体外后体内维持细胞的方法，该条件允许长期维持、扩增和/或分化，该方法包括(a)提供细胞；以及(b)在无血清培养基中以及在具有或不具有其他细胞外基质成分和具有或不具有激素或生长因子的透明质酸复合物上培养细胞，以维持、繁殖和/或分化细胞群。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肝干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是成肝细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是定向祖细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是成熟细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸与其他细胞外基质成分和/或激素或 者生长因子复合。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞外基质成分是一种或一种以上胶原蛋白 (例如III型胶原蛋白)、一种或一种以上基底粘附分子(例如层粘连蛋白)、一种或一种以 上蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链(例如肝素蛋白聚糖)或者它们的混合物。
8.如权利要求5所述的方法，其进一步包括一种或一种以上激素。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述激素是胰岛素、转铁蛋白/Fe、三碘甲腺原氨酸、 T3、生长激素、胰高血糖素，或者它们的组合。
10.如权利要求5所述的方法，其进一步包括一种或一种以上生长因子。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述生长因子是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞 生长因子(FGF)、白细胞介素、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子(TGF-日)，或者它 们的组合。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述白细胞介素是IL-6、IL-11、IL-13，或者它们的组合。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸被化学交联。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述透明质酸通过醛桥被化学交联。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述透明质酸通过二硫桥被化学交联。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞外基质包括通过二硫桥交联的透明质 酸,称为 Extracell-LGTM。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质进一步包括一种或一种以上特异 性胶原蛋白、一种或一种以上基底粘附分子的特异性同种型、一种或一种以上种类特异性 或组织特异性蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链、一种或一种以上激素和/或一种或一种以上 生长因子，或者它们的混合物。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞从肝脏中获得。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是成人肝细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述肝脏是胎儿的肝脏。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述肝脏是新生儿的肝脏。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述肝脏是儿童的肝脏。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述肝脏是成人肝脏。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基包括胰岛素、转铁蛋白或它们两者。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基主要由胰岛素、转铁蛋白、脂类、 钙、锌和硒组成。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基主要由胰岛素、转铁蛋白、脂类、 钙、锌和硒组成。
27.如权利要求1所述的方法，其中，所述无血清培养基不含任何生长因子或除胰岛素 和转铁蛋白之外的任何激素。
28.一种先体外后体内繁殖细胞的方法，其包含(a)提供细胞；(b)在无血清培养基上以及在透明质酸上培养细胞以使细胞群能够长期生存、扩增和 /或分化。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞是成肝细胞。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞是定向祖细胞。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞是成熟的肝细胞或者胆细胞。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞外基质进一步包括一种或一种以上胶 原蛋白、一种或一种以上基底粘附分子、一种或一种以上蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖(GAG) 链、一种或一种以上激素、一种或一种以上生长因子，或者它们的组合。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述胶原蛋白是I型、III型、IV型或V型胶原蛋白。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述基底粘附分子是层粘连蛋白的同种型或纤连 蛋白或它们两者。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述蛋白聚糖/GAG是肝素、肝素蛋白聚糖、硫酸软 骨素/硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤素/硫酸皮肤素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素/硫酸乙酰 肝素蛋白聚糖，或者它们的组合。
37.如权利要求28所述的方法，其中所述透明质酸被化学交联。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述透明质酸通过醛桥被化学交联。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述透明质酸通过二硫桥被化学交联。
40.一种组合物，其包含细胞的细胞培养物、无血清培养基以及含有透明质酸的细胞外 基质复合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞是成肝细胞。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞是定向祖细胞。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞是成熟的肝细胞或成熟的胆上皮细胞。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞外基质进一步包含一种或一种以上胶原 蛋白、一种或多种基底粘附分子、一种或一种以上蛋白聚糖或它的/它们的GAG链、一种或 多种激素、一种或一种以上生长因子，或者它们的组合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述胶原蛋白是III型胶原蛋白。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述基底粘附分子是层粘连蛋白。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述蛋白聚糖/GAG是肝素或肝素蛋白聚糖。
49.如权利要求40所述的方法，其中所述透明质酸被化学交联。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述透明质酸通过醛桥被化学交联。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述透明质酸通过二硫桥被化学交联。
52.一种用于肝祖细胞繁殖的容器，其包括(a)容器，以及(b)含有透明质酸和至少一种其他细胞外基质成分的不溶性材料，所述至少一种其他 细胞外基质成分选自胶原蛋白、基底粘附蛋白、蛋白聚糖或它们的糖胺聚 糖链、激素以及 生长因子，其中所述不溶性材料存在于容器内的悬浮液中或基本覆盖容器的至少一个表
53.如权利要求52所述的容器，其中所述容器是组织培养平板、生物反应器、实验用细 胞或实验用芯片。
54.如权利要求52所述的容器，其中所述胶原蛋白是I型、III型、IV型、V型、VIII 型、XII型、XIII型胶原蛋白或者它们的组合。
55.如权利要求52所述的容器，其中所述基底粘附蛋白是层粘连蛋白的同种型或纤连蛋白。
56.如权利要求52所述的容器，其中所述糖胺聚糖是硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨 素、硫酸皮肤素，或者它们的组合。
57.如权利要求52所述的容器，其中所述蛋白聚糖的糖胺聚糖链是硫酸乙酰肝素-PG、 肝素-PG、硫酸软骨素-PG、硫酸皮肤素-PG，或者它们的组合。
58.如权利要求52所述的容器，其中所述激素是胰岛素、转铁蛋白/Fe、生长激素、三碘 甲腺原氨酸、胰高血糖素，或者它们的组合。
59.如权利要求52所述的容器，其中所述生长因子是表皮生长因子(EGF)的同种型、 成纤维细胞生长因子(FGF)的同种型、转化生长因子(TGF-0)的同种型、肝细胞生长 因子(HGF)的同种型、白血病抑制因子(LIF)的同种型、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素 11 (IL11)、白细胞介素13 (IL13)、制癌蛋白M,或者它们的组合。
60.如权利要求58所述的容器，其中所述肾上腺皮质素是皮质醇。
全文摘要
本发明提供一种在透明质酸上或内先体外后体内繁殖包括肝祖细胞在内的肝细胞的方法，所述透明质酸具有或不具有其他细胞外基质成分(例如胶原蛋白、基底粘附分子、蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖)以及具有或不具有激素和/或生长因子。本发明还公开了包含上述基质的组合物。另外，本发明的复合物可以用于先体外后体内的组织工程或者可被用作将被体内移植的细胞移植物的支架。
文档编号C12N1/02GK101855340SQ200880014827
公开日2010年10月6日 申请日期2008年3月5日 优先权日2007年3月6日
发明者威廉姆·S·特纳, 洛拉·M·里德 申请人:北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校