24个y染色体str基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明提供一种24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒，属于生物检测技术领域，该试剂盒能同时扩增分析STR基因座DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643，本发明采用四色荧光标记，扩增产物大小在100-400bp之间，操作简单，并提供了很高的累计个体识别力和累积非父排除率。
【专利说明】
24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，设计检测人体基因组中的短串联重复序列基因座 多态性，具体地，本发明设计24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前DNA检测技术已经广泛应用于法医DNA分析、亲缘关系鉴定、细胞系鉴定、医 学遗传学、人类学等领域。而应用最广泛的DNA分析即为遗传标记的分析，多数的DNA分析 方法的核心技术在于片段长度多态性和序列多态性的分析。
[0003] 近年来，随着短串联重复序列的发现与技术发展使其成为目前应用最广泛的DNA 分析技术。在大多数的案件中，由于其在人群中的高度遗传多样性，常染色体STR基因座被 广泛应用，然后Y染色体由于其特殊的非重组性质，使其可以应用于同一父系关系的亲缘 关系研究。
[0004] 人类Y染色体特异的短串联重复序列即Y_STR(short tandem repeat, STR)，为人 类男性所特有，按父系单倍型遗传，在法医学亲子鉴定和个体识别、人类种群学、类起源和 进化研究中具有独特的应用价值，在无创伤性产前基因诊断的研究工作中也具有重要应 用前景。Y染色体在很多案件的应用中具有其特殊的价值，如在性侵案件中，男性DNA样本 中常常混有很多女性DNA样本，Y染色体STR的可以特异性地从混合样本中检测出，此外，Y 染色体STR可以应用于父系亲缘关系的鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并提供了一 种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，本发明所提供的试 剂盒操作简单、快速，系统多态性高，均衡性好，灵敏度高，可以应用在法医鉴定及亲子鉴定 等领域中。
[0006] 24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，包括24对特异性引物，能同时扩 增 24 个 Y 染色体 STR 基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、 DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643,所述 24 对特异性引物见下表如述：
[0007]
[0008]
[0010] 所述特异性引物的浓度分别为：
[0011]
[0014] 所述扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为 同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4 为第一组； DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533 为第二组；DYS456、DYS389I/II、DYS390、 DYS438、DYS576 为第三组；DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 为第四组。
[0015] 所述第一组米用FAM标记，第二组米用HEX标记，第二组米用TAMRA标记，第四组 采用R0X标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5'端。
[0016] 所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。
[0017] 所述等位基因标准物采用橙色标记物0RG标记。
[0018] -种试剂盒，包括上述任一扩增体系。
[0019] 上述扩增体系或试剂盒在法医DNA分析、亲子鉴定中的应用，所述应用为采用上 述扩增体系或试剂盒用于检测DNA样本。
[0020] 所述DNA样本来源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、体液、毛发、肌肉以及其他组织 器官。
[0021] 所述DNA样本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法、酚氯仿提取法 而得到。
[0022] 本发明的技术方案的设计思路：
[0023] (一）Y染色体STR基因座的确定
[0024] 本发明共调查了 35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性，最后确 定了多个具有高度遗传多态性的Y染色体遗传标记，包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、 DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/ II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 等 24 个基因座。 这些基因座可以与现在市面上使用较为广泛的试剂盒兼容，保证了已有DNA数据的比对和 交流，在此基础上增加位点提高了累计个体识别力和累积非父排除率。
[0025] (二）五色荧光标记的确定
[0026] 本发明采用了五色荧光标记技术，将上述24个Y染色体STR基因座分成四组， DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4,采用 FAM 荧光标记；DYS460、DYS458、 DYS481、DYS635、DYS448、DYS533，采用 HEX 荧光标记；DYS456、DYS389I/II、DYS390、 DYS438、DYS576,采用 TAMRA 荧光标记；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643,采用 R0X荧光标记。内标采用橙色标记物0RG标记。
[0027] (三）本发明进一步提供了 24个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物 对：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、 DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、 DYS385a/b、DYS643。
[0028] (四）24个Y染色体STR基因座的等位基因范围、Genbank登记号、参考序列见下 表：
[0030] 扩增相应STR基因座的引物对有一定的序列，这些引物在扩增体系中有一定的浓 度，所述各个引物浓度见下表。
[0031]
[0033] 本发明的有益效果和优点：
[0034] 本发明所提供的 DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、 DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 这 24 个 Y 染色体 STR 基因座包含了市场上使 用最广泛的ABI公司的Yfiler的17个位点，在此基础上又增加了 7个位点，提高了累积个 体识别力和累积非父排除率。
[0035] 本发明所提供试剂盒与国内外试剂盒比较
[0036]
[0037]
[0038] 本发明采用四色荧光标记，扩增产物大小在100_400bp之间，操作简单，并提供了 很高的累计个体识别力和累积非父排除率。本发明所提供的试剂盒操作简单、快速，系统多 态性高，均衡性好，灵敏度高，完全能够满足个体识别、亲缘关系鉴定以及DNA数据库建设 的需要。
[0039] 本发明的优势
[0040] 1、更高的累积个体识别力和累积非父排除率，应用该体系对600个无关男性个体 进行检测，共检测出599个单倍型，个体识别力达到99. 83 %。
[0041] 通过计算得到如下统计学参数：HD(单倍型多样性）=0· 99999165275
[0042] 每个基因座的⑶值
[0045] 所有基因座的累积非父排除率TGD = 1，累积个体识别率和累积非父排除率相等。
[0046] 2、物种特异性强
[0047] 应用该体系扩增了包括鸡、猪、鼠、猫、狗、兔子、马、鹿以及大肠杆菌等物种的DNA 样本，均没有检测出特异性扩增峰。
[0048] 3、混合样本的检测
[0049] 在男性DNA模板与女性DNA模板的比例达到1:400时，仍能有效检测出24个Y染 色体STR基因座，无任何基因座丢失。
【附图说明】
[0050] 图1男性个体1的DNA检测图，
[0051] 图2男性个体2的DNA检测图，
[0052] 图3牛的DNA检测图，
[0053] 图4羊的DNA检测图，
[0054] 图5鸡的DNA检测图，
[0055] 图6鱼的DNA检测图，
[0056] 图7男性样本A的DNA检测图，
[0057] 图8男性样本B的DNA检测图，
[0058] 图9男性样本A+女性样本C的DNA检测图，
[0059] 图10男性样本B+女性样本C的DNA检测图。
【具体实施方式】
[0060] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0061] 实施例1
[0062] 1、124个Y染色体STR基因座的选择、荧光标记组合以及引物设计
[0063] 通过对35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性进行统计学分析， 确定了包括 DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、 DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、 DYS437、DYS385a/b、DYS643在内的24个具有高度遗传多态性的Y染色体STR基因座。这 些基因座提高了系统的累积非父排除率和累计个体识别力，能够更好地满足法医DNA检测 的技术要求。
[0064] 将24个基因座分成四组，分别采用FAM、HEX、TAMAR、R0X的荧光染料进行标记， 通过反复多次实验验证后，确定最优荧光染料组合方案，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、 DYS549、Y-GATA-H4,采用 FAM 荧光标记；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533， 采用 HEX 荧光标记；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576,采用 TAMRA 荧光标记； DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643，采用 R0X 荧光标记。
[0065] 针对上述每个基因座设计一对引物，单对引物进行扩增实验，确保不会引起非特 异扩增后，24对引物复合扩增，重新设计可能引起非特异的引物，直到体系中无非特异扩增 出现，根据引物对效率的高低调整复合扩增体系中引物的浓度。
[0066] 1、2复合扩增体系中各组分的优化
[0067] 基于反应体系10ul优化体系中酶的含量和Mg2+的浓度进行优化，酶含量梯度为 0. 5U、1. 0U、1. 5U、2. 0U，镁离子浓度梯度为1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. OmM，设计正交实验，共 16组，最后确定复合扩增体系中成分的最优组合。
[0068] 1、3热循环参数优化
[0069] 确定了体系中酶的含量和镁离子的浓度后，对热循环参数进行优化，针对扩增循 环数大小进行梯度实验，27个循环、29个循环、31个循环以及33个循环四个梯度进行实验， 确定最优扩增循环数为31个循环。退火温度是在确定了循环数后进行优化，在31个扩增循 环数下，退火温度分别设置56 °C、58 °C、60 °C、62 °C、64°C，确定最优的退火温度为60 °C。另 外也可以兼容不同PCR仪之间的温度差异。
[0070] 1、4确定本发明推荐使用的反应体系和热循环参数
[0071] 反应体系
[0073] 热循环参数
[0074]
[0075] 1、5扩增产物的毛细管电泳检测
[0076] 在检测前，对产物进行变性处理并与分子量内标混合，lul产物+0. 5ul分子量内 标+8. 5ul的HIDI (去离子甲酰胺），混匀后短暂离心，95°C变性5min后立即冰浴lOmin，用 ABI系列遗传分析仪进行电泳检测。
[0077] 无关个体的24个Y染色体STR基因座检测结果，男性个体1、男性个体2的检测图 见图1、图2。
[0078] 实验例2物种特异性验证报告 [0079] 实验目的：
[0080] 测试 Microreader?24Y Direct ID System 的物种特异性
[0081] 1.实验仪器与试剂
[0082] 1. 1 实验仪器：9700-金（ΑΒΙ)
[0083] 1. 2实验试剂：配套BufferB和TaqII、引物混合物（自配）
[0084] 2实验方法
[0085] 取纯净猪、牛、羊、小鼠、鸡、鸭、鱼及人类模板各一个。
[0086] 2. 1扩增程序
[0087]
[0088] 2· 2扩增体系
[0089]
[0090] 2.3毛细管电泳：ΑΒΙ 3500检测（进样电压3.0KV，进样时间4秒），数据分析采用 Genemapper ID-X 软件。
[0091] 3.实验结果，见图3、4、5、6。
[0092] 本发明的扩增体系作为身份鉴定系统在猪、牛、羊、小鼠、鸡、鸭、鱼等均不能有效 扩增，只在人类DNA获得扩增，具有较好的物种特异性。
[0093] 实施例3混合模板扩增能力验证报告
[0094] 实验目的：
[0095] 测试Microreader?24Y Direct ID System男女混合模板扩增能力
[0096] 1.实验仪器与试剂
[0097] 1. 1 实验仪器：9700-金（ABI)
[0098] 1. 2实验试剂：配套BufferB和TaqII、引物混合物（自配）
[0099] 2实验方法
[0100] 纯净男性模板2个编号A，B ;纯净女性模板编号C。A、B与C分别按照1:500的比 例进行混合。
[0101] 2.1扩增程序
[0102]
[0103] 2. 2扩增体系
[0104]
[0105] 2.3毛细管电泳：ABI 3500检测（进样电压3.0KV，进样时间4秒），数据分析采用 Genemapper ID-X 软件。
[0106] 4.实验结果：
[0107] 样本A基因型见图7,样本B基因型见图8,样本A+C混合基因型见图9,样本B+C 混合基因型，见图10。
[0108] 本发明的扩增体系作为身份鉴定系统在男女混合模板中有良好的扩增能力，结果 稳定，不影响分型。
【主权项】
1. 24个Y染色体STR基因座的复合扩增体系，包括24对特异性引物，能同时扩增24个 Y 染色体 STR 基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、 DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643,所述 24 对特异性引物见下表如述：2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述特异性引物的浓度分别为：3. 根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述扩增体系中的被扩增基因座分别由四 种颜色的巧光标记，相同巧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、 0￥5392、0￥5549、￥-6414寸4为第一组；0￥5391、0￥5439、0￥5481、0￥5635、0￥5448、0￥5533 为 第二组；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576 为第S组；DYS460、DYS458、DYS437、 DYS385a/b、DYS643 为第四组。4. 根据权利要求3所述的复合扩增体系，所述第一组采用FAM标记，第二组采用肥X标 记，第=组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述巧光标记位于特异性引物对中其中 一条引物的5'端。5. 根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标 准物。6. 根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述等位基因标准物采用澄色标记物ORG标 记。7. -种试剂盒，包括权利要求1-6任一复合扩增体系。8. 权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒在法医DNA分析、亲子鉴定 中的应用，所述应用为采用权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒用于检 DNA样本。9. 权利要求8所述的应用，所述DNA样本来源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、体液、毛 发、肌肉W及其他组织器官。10. 权利要求9所述的应用，所述DNA样本采用化elex-100提取法、磁珠提取法、试剂 盒提取法或酪氯仿提取法而得到。
【文档编号】C12Q1/68GK105986022SQ201510076934
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月13日
【发明人】于在亮, 赵洪玉, 付亮剑, 陈初光
【申请人】苏州阅微基因技术有限公司