专利名称：用于定量检测her2扩增的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒。具体地说，本发明涉及通过定量检测HER2扩增来诊断癌症的试剂盒。
背景技术：
我国每年新发乳腺癌约18万例。在近三成乳腺癌患者中，其肿瘤细胞表面的HER2 蛋白含量增多，这种情况被称为“HER2阳性”。HER2又被称作人表皮生长因子受体2，在调控细胞的生长、发育和分化中发挥重要作用。一旦过度表达(即HER2阳性)，HER2便会刺激癌细胞疯狂增长，使其侵袭性增加。因此，HER2阳性乳腺癌的进展速度比其它类型乳腺癌更快，恶性程度更高，复发和转移更快[Burstein HJ, N Engl J Med, 2005, 353 (16) 1652-1654]。研究结果表明，如果只接受常规综合治疗，HER2阳性乳腺癌患者的生存时间仅为HER2阴性患者的一半。HER2阳性乳腺癌患者可从曲妥珠单抗(Herceptin)单药方案或与部分化疗药物联合方案中获益[Piccart-GebHERt MJ, Procter Μ, et al. NEngl J Med, 2005, 353 (16) 1659-1672 ；Romond EH, Perez EA, et al. NEngl J Med，2005，353 (16) :1673-1684]。单克隆抗体Here印tin与HER2受体细胞外区域结合，具有高度亲和力和特异性，既能阻断HER2 受体而产生抗肿瘤效应，又能与人体免疫细胞作用，产生抗体依赖性细胞毒(ADCC)效应和补体介导细胞毒(CDC)效应。Here印tin单药对于HER2阳性的转移性乳腺癌的治疗总有效率为23%，对其中HER2(+++)患者的有效率达31%。目前临床上Here印tin主要用于治疗 HER2基因扩增或过度表达且伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者[Pegram MD, Konecny GE, et al. J Natl Cancer Inst，2004，96 (10) :739-749]。由此可见，如果能够及早确定 HER2 的扩增或表达状态，便可及早使患者接受更佳的治疗方案，让患者拥有更多的生存机会。在《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2007版)》、《乳腺癌HER2检测指南》 (2009版)、《乳腺癌临床实践指南(中国版)》(2009年第一版)中均指出对于HER2免疫组化结果不明确的患者，需要应用FISH检测来确定。然而，FISH检测价格较为昂贵，导致不少乳腺癌患者丧失了检测机会。有研究表明，实时荧光PCR法与FISH方法检测乳腺癌组织样本的一致性高，且可能具有更高的灵敏度[Gjerdrum LM, Sorensen BS, et al. J Mol Diagn,2004,6(1) :42-51]。本试验所用人HER2基因扩增定量检测试剂盒(实时荧光PCR法)相对于FISH检测具有以下优点1.样本处理过程简便，实验周期短，实验操作易于标准化。2.价格适中，易于临床推广。3.定量准确，这是本试剂方法最独特的优点。通过实时荧光PCR扩增曲线参数，定量测定样本中HER2基因拷贝数。4.减少人为实验误差。FISH检测易因主观因素造成结果误判，同时也受到检测者专业知识和实验室条件的限制，且目前FISH检测试剂价格较高，很难大面积推广。人HER2基因扩增定量检测试剂盒(实时荧光PCR法)是第一个实现HER2基因扩增检测批量化、标准化的产品。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种HER2基因扩增的定量检测试剂盒。为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10 X Taq缓冲液、MgCl2, dNTP混合液及可特异性扩增HER2基因的PCR引物与探针的定量检测试剂盒及检测方法(1)针对HER2基因组DNA设计上下游引物及特异性的探针，该引物可以特异性的扩增HER2基因组的一段序列，该探针可与HER2特异性结合。(2)为定量检测HER2扩增比例，本发明设计了内参，针对内参基因ACTB基因组 DNA设计上下游引物及特异性的探针，该引物可以特异性的扩增ACTB基因组的一段序列， 该探针可与ACTB特异性结合。(3)为定量检测HER2扩增比例，本发明设计了标准品，对待测样品与标准品进行 HER2与内参基因的荧光定量PCR检测。(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的HER2基因与ACTB基因的比例。所述步骤⑴之前还包括对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。针对HER2基因组DNA，荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与HER2的碱基特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。 所述的荧光发射基团选自FAM、ΤΕΤ、HEX、ROX ；所述的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMARA。优选的，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12。针对内参基因ACTB基因组DNA，荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与ACTB的碱基特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发射基团选自FAM、ΤΕΤ、HEX、ROX ；所述的荧光淬灭基团选自BHQ、 TAMARA。优选的，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14。所述标准品至少包括质粒、基因组DNA或化学合成序列中的一种。优选地，所述标准品为质粒，所述含部分HER2基因序列的质粒的序列为SEQ ID NO 15 ；所述含部分ACTB 基因序列的质粒的序列为SEQ IDNO :16ο所述待检样品包括新鲜组织、石蜡包埋组织。所述引物由上游引物与下游引物组成。所述HER2引物优选为SEQID NO :3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 ；所述 ACTB 引物优选为 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10。所述HER2基因扩增的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂如上所述的引物、探针和对照品。所述试剂盒优选还包括Taq酶、10XTaq缓冲液、MgCl2、dNTP混合液。优选的引物与探针的比例为2 1-10 1，优选的正向与反向引物之间的比例为1 3-3 1。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2所用标准品构建方法示意图。图2是本发明实施例2质粒图谱，箭头所指即为载体中插入基因PCR产物序列的位置。图3是本发明实施例2的HER2质粒标准品测序结果图。图4是本发明实施例2的ACTB质粒标准品测序结果图。图5是本发明实施例3的标准品扩增曲线图，其中图A是HER2质粒标准品扩增曲线，图B是ACTB质粒标准品扩增曲线。图6是根据图5绘制的标准曲线图，其中图A是HER2质粒标准曲线，图B是ACTB 质粒标准曲线，图7是本发明实施例3的样本HER2基因扩增曲线图，其中图A是石蜡包埋组织扩增曲线图；图B是新鲜组织扩增曲线图。图8是本发明实施例3的样本ACTB基因扩增曲线图，其中图A是石蜡包埋组织扩增曲线图；图B是新鲜组织扩增曲线图。图9是本发明的定量方法示意图。
实施例以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(Sambrook J.)，或按照厂商所建议的条件。实施例1 人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织基因组DNA抽提我们所测试的人类新鲜乳腺癌肿瘤组织、石蜡包埋乳腺癌组织。标本DNA抽提可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提DNA浓度与纯度 (0D260/0D280约为1. 8，0D260/0D230大于2. 0)。下面以使用Promega公司的DNA提取试剂盒为例介绍样本DNA提取步骤1.新鲜组织DNA抽提(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织，置于研钵中，将组织剪碎，加液氮研成粉末。(2)加入600 μ 1预冷的裂解液于研钵中，用Iml大枪头吹打6次，尽量使组织粉末与裂解液混勻，转移混合物到1. 5ml EP管中，上下颠倒6次混勻后65°C水浴20分钟。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下颠倒6次混勻，37 °C水浴20分钟。(4)冷却到室温，加200 μ 1蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混勻，冰上放置5分钟后 13，000*g，室温离心4分钟。(5)转移上清至事先加600 μ 1异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混勻6次后 13，000*g，室温离心1分钟。(6)弃上清，加600μ1 70%乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混勻后 13，000*g，室温离心1分钟。
(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小时或4°C过夜。2.石蜡包埋组织DNA抽提(1)将Img或少于Img的组织放入1. 5ml离心管内。(2)加入新鲜制备的100 μ 1温育缓冲液/蛋白酶K溶液。根据样品的类型，56°C 温育过夜。(3)取出温育的样品管，加入两倍体积的裂解缓冲液。(4)高速涡旋振荡树脂10秒钟至树脂完全悬浮，加入7 μ 1完全悬浮的树脂。高速涡旋振荡3秒钟后室温温育5分钟。(5)高速涡旋振荡2秒钟，将管子放在MagneSpHER2e 磁分离架上。磁分离立刻进行。(6)小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。(7)加入100 μ 1裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。(8)将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液。(9)加入100 μ 1配制的Ix洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。(10)将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液。(11)重复步骤9和10两次，共3次洗涤，并确保在最后一次洗涤后，除去所有的液体。(12)打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟。(13)加入25 μ 1洗脱液。(14)盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。65°C温育5分钟。(15)取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟。立即放到磁分离架上。(16)将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。实施例2 阳性标准品的准备1载体的准备TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。2插入片段的准备使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件如下表(表1、表2、表3)表1 =PCR 反应体系(50 μ 1)
权利要求
1.一种聚合酶链式反应引物，其在适宜的PCR条件与HER2基因或ACTB基因发生反应。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物与下游引物组成。
3.如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述引物的序列为SEQID N0:3、SEQ ID NO :4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQID N0:8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10o
4.一种荧光定量PCR探针，其在适宜的PCR条件下与HER2基因或ACTB基因碱基序列特异性结合。
5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
6.如权利要求4或5所述的探针，其特征在于，所述探针的序列为SEQID NO=IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO: 14。
7.一种质粒，该质粒包含待检测的HER2基因或ACTB基因序列。
8.如权利要求7所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的HER2基因序列为SEQID NO 15，ACTB 基因序列为 SEQ ID NO :16。
9.一种HER2基因扩增的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自以下的试剂如权利要求1-3任一项所述的引物、权利要求4或5所述的探针、以及权利要求7或8 所述的质粒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，引物与探针的比例为2 1-10 1，正向与反向引物之间的比例为1 3-3 1。
全文摘要
本发明涉及用于定量检测HER2扩增的试剂盒。具体地说，本发明涉及与分子靶向抗癌药物疗效相关的HER2基因扩增检测方法及检测试剂盒。尤其涉及荧光定量PCR检测方法、试剂盒及其应用。本发明对HER2基因扩增进行检测，并可对分子靶向抗肿瘤药曲妥珠单抗进行疗效预测，进而对肿瘤患者的临床个体化用药方案提供指导。
文档编号C12N15/11GK102373197SQ20101025540
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者李隽 , 莫敏俐, 许军普, 陈钊 申请人:北京雅康博生物科技有限公司