一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品，R1试剂由七种原料制成；R2试剂由四种原料制成；校准品由四种原料制成。本试剂盒的使用采用半自动或全自动生化仪，通过化学比色法定量检测尿液中巯基的含量，根据检测值的高低筛查宫颈癌患者。通过检测尿液中的巯基，不存在因采样误差而漏检的问题，比形态学方法更加微观、更早期发现这类病人。而使用半自动、全自动生化仪检测，检查费用低廉，工作效率大幅度提高，特别适合大规模宫颈癌普查；本试剂盒的使用采用液体双试剂、双波长法检测尿液中的巯基，简便可靠，且不受色素、蛋白等其他物质的干扰，特异性好。
【专利说明】一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地说，涉及一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]传统的宫颈癌检测主要有液基细胞学(TCT)、阴道镜、巴氏涂片、醋酸白、人类乳头瘤病毒(HPV)等检查方法，然而上述几种方法都属于形态学方法，就是说细胞恶变到了显微镜或肉眼可见的程度才能被发现，并且都需要专业技术人员操作，都存在宫颈采样造成漏检的缺陷，采样时都会对病人造成创伤，并且县区级医院没有条件开展TCT、阴道镜、病理检查等。近年来，有采用类似试剂盒的方法，但是采用手工操作，操作步骤繁琐，操作时间长，属于定性或半定量的测定方法，抗干扰能力差，自动化程度低，无法满足临床上大规模快速检测的需求。因此，研制一种:1)安全可靠；2)取样简单、客观、没有认为误差；3)无创伤性；4)快速简便；5)价格低廉；6)适合大规模临床筛查，这无疑对临床诊断广大妇女的疾病具有重要作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种分子水平的检测方法，采用比色法定量检测尿液中巯基的含量，从而筛查妇女宫颈癌的试剂盒。
[0004]本发明提供如下的技术方案:
[0005]一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和校准品，
[0006]所述的Rl试剂由十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、TritonX-100,NaN3与EDTA这七种原料制成缓冲液；
[0007]所述的R2试剂由5，5 ' -二硫代双(2-硝基苯甲酸)、乙二醇、柠檬酸盐缓冲液与NaN3这四种原料制成显色液；
[0008]所述的校准品由半胱氨酸、乙二醇、磷酸盐缓冲液与NaN3这四种原料制成校准品;
[0009]Rl试剂、R2试剂和校准品中的相同的原料均为各自单独使用的原料。
[0010]所述的Rl试剂各组分(即原料)的浓度优选如下:
[0011]十二水磷酸氢二钠0.1% -1% ；
[0012]磷酸二氢钾0.01% -0.1% ；
[0013]氯化钾lmM(即 ImM 就是 0.001mol/L, M 为 mol/L,下同);
[0014]氯化钠150mM;
[0015]TritonX-1OO 0.1% -1% ；
[0016]NaN3 0.1%。
[0017]EDTA 5mM_25mM。
[0018]所述的R2试剂各组分的浓度优选如下:
[0019]5，5丨-二硫代双(2-硝基苯甲酸)0.01% -0.1% ;
[0020]乙二醇1% -5% ；
[0021 ] 1mM, pH值4.0-6.0的柠檬酸盐缓冲液；
[0022]NaN3 0.1%。
[0023]所述的校准品各组分的浓度优选如下:
[0024]半胱氨酸500μΜ;
[0025]乙二醇5% ；
[0026]1mM, ρΗ7.0磷酸盐缓冲液；
[0027]NaN3 0.1%。
[0028]上述Rl试剂、R2试剂和校准品各原料的溶剂为水，单位M的含义为mol/L，单位百分数的含义为对应的原料的重量与10ml水的重量的重量比，从而例如NaN3 0.1%即表示每10ml的水中含有0.1g的NaN3。下同。
[0029]进一步地，
[0030]Rl试剂中磷酸氢二钠的最适浓度为0.716% ；
[0031]Rl试剂中磷酸二氢钾的最适浓度为0.054% ；
[0032]Rl试剂中TritonX-1OO的最适浓度为0.1% ;
[0033]Rl试剂中EDTA的最适浓度为5mM。
[0034]R2试剂中5，5 ^ - 二硫代双(2_硝基苯甲酸)的最适浓度为0.05% ;
[0035]R2试剂中乙二醇的最适浓度为5% ；
[0036]R2试剂中柠檬酸盐缓冲液的最适pH值为5.0。
[0037]本宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒的工作原理如下:
[0038]采用半自动或全自动生化仪，通过化学比色法定量检测尿液中巯基的含量，其原理是:尿液中的巯基物质与试剂中的5，5丨-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应，产生410± 15nm的特异的吸收峰，测定其吸光值，根据标准曲线计算尿液中的巯基含量，其含量的高低与宫颈癌具有良好的相关性。
[0039]本发明的有益效果在于:
[0040]I)检测尿液中的巯基，不存在因采样误差而漏检的问题，比形态学方法更加微观、更早期发现这类病人。
[0041]2)使用半自动、全自动生化仪检测，检查费用低廉，10分钟内出结果，工作效率大幅度提高，特别适合大规模宫颈癌普查。
[0042]3)采用液体双试剂、双波长法检测尿液中的巯基，简便可靠，且不受色素、蛋白等其他物质的干扰，特异性好。
【具体实施方式】
[0043]以下结实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。
[0044]实施例
[0045]实施例1:宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒的制备
[0046]—种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，是由Rl缓冲液体系(即Rl试剂)、R2显色体系(即R2试剂)、校准品和使用说明书组成。
[0047]I)以制备I升Rl缓冲液体系为例，称取十二水磷酸氢二钠7.16克、无水磷酸二氢钾0.54克、氯化钾0.075克、氯化钠8克、TritonX-1OO I克、二水EDAT 二钠1.86克、NaN3I克，加入IL的蒸馏水溶解搅拌均匀。
[0048]2)以制备I升R2显色体系为例，称取5，5 ^ -二硫代双(2_硝基苯甲酸)0.25克、乙二醇50毫升、NaN3 I克、二水柠檬酸钠2.94克、加入800毫升蒸馏水溶解，用稀盐酸调节pH值5.0,最后定容至I升。
[0049]3)以制备I升试剂盒校准品为例，称取半胱氨酸盐酸盐138.38毫克、乙二醇50毫升、十二水磷酸氢二钠3.58克、无水磷酸二氢钾0.27克、NaN3 I克，加入I升的蒸馏水溶解搅拌均匀。
[0050]实施例2:宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒的使用方法
[0051]检测仪器:东芝TBA-120FR全自动生化分析仪；分析方法:两点终点法，具体参数为:温度37度；主波长412nm ;副波长700nm ;样品:24yL ；R1试剂:200yL ；R2试剂:40 μ L ;校准方式:两点校准；反应方向:+。
[0052]样本加入后，加入Rl试剂混匀，反应3-5分钟后，读取吸光值Al，再加入R2试剂混匀，反应5分钟后，在主波长412nm，副波长700nm读取吸光值A2，计算Λ A = Α2-Α1，样本中巯基含量(μ mol/L)=标准浓度X Λ A测定/Λ A标准，即可计算出待测样本中巯基的含量。如果血清或尿液样本中巯基的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。
[0053]实施例3:宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒的临床验证
[0054]研究对象:选取某医院妇科门诊就诊及体检的200例女性。其中62例经临床妇科检查、TCT及病理活检确诊为宫颈癌患者，88例患有其它妇科疾病但是经临床妇科检查、TCT及病理活检显示宫颈正常患者，另有50例经体检为健康女性。
[0055]标本采集:禁食8个小时后，用尿杯取次日晨尿约2ml，并于2小时内送检。
[0056]检测仪器:东芝TBA-120FR全自动生化分析仪。
[0057]分析方法:采用两点终点法。
[0058]具体参数为:温度37度；主波长412nm ;副波长700nm ;样品:24μ L ；R1试剂:200 μ L ；R2试剂:40 μ L ;校准方式:两点校准；反应方向:+。
[0059]操作步骤:样本加入后，加入Rl试剂混匀，反应3-5分钟后，读取吸光值Al，再加入R2试剂混匀，反应5分钟后，在主波长412nm，副波长700nm读取吸光值A2。
[0060]结果计算:Λ A = A2-A1,样本中巯基含量(μπιοΙ/L)=标准浓度χΛΑ测定/ Δ A标准，计算出待测样本中巯基的含量。
[0061]数据分析:采用SPSS软件进行统计分析，t检验比较数据间差异，设定P < 0.05时有统计学意义。
[0062]结论:由表I可知，宫颈癌患者组较健康女性明显升高，t检验差异有高度显著性(p〈0.05)，而治其他妇科疾病患者组略高于健康女性组，无显著差异(P0.05)，说明本试剂盒对女性宫颈癌的诊断筛查具有重要的临床应用价值。
[0063]表1 200例女性尿液中的巯基含量(X 土SE)
【权利要求】
1.一种宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂、R2试剂和校准品， 所述的Rl试剂由十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、TritonX-100, NaN3与EDTA这七种原料制成缓冲液； 所述的R2试剂由5，5 ' -二硫代双(2-硝基苯甲酸)、乙二醇、柠檬酸盐缓冲液与NaN3这四种原料制成显色液； 所述的校准品由半胱氨酸、乙二醇、磷酸盐缓冲液与NaN3这四种原料制成校准品； Rl试剂、R2试剂和校准品中的相同的原料均为各自单独使用的原料。
2.根据权利要求1所述的宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，所述的Rl试剂各原料的浓度如下: 十二水磷酸氢二钠0.1% -1% ; 磷酸二氢钾0.01% -0.1% ; 氯化钾ImM ； 氯化钠150mM;
TritonX-1OO 0.1% -1% ；
NaN3 0.1% ；
EDTA 5mM-25mM ； 上述各原料的溶剂为水，单位M的含义为mol/L，单位百分数的含义为对应的原料的重量与10ml水的重量的重量比。
3.根据权利要求1所述的宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，所述的R2试剂各原料的浓度如下:5,5; -二硫代双(2-硝基苯甲酸)0.01%-0.1% (重量比)； 乙二醇 1% -5% ；1mM, pH值4.0-6.0的柠檬酸盐缓冲液；
NaN3 0.1% ； 上述中各原料的溶剂为水，单位M的含义为mol/L，单位百分数的含义为对应的原料的重量与10ml水的重量的重量比。
4.根据权利要求1所述的宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品各原料的浓度如下: 半胱氨酸500 μ M ; 乙二醇5% ；1mM, ρΗ7.0磷酸盐缓冲液；
NaN3 0.1% ； 上述各原料的溶剂为水，单位M的含义为mol/L，单位百分数的含义为对应的原料的重量与10ml水的重量的重量比。
5.根据权利要求2所述的宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，Rl试剂中，磷酸氢二钠的浓度为0.716% ; 磷酸二氢钾的浓度为0.054% ； TritonX-1OO 的浓度为 0.1% ； EDTA的浓度为5mM。
6.根据权利要求3所述的宫颈癌筛查快速定量检测试剂盒，其特征在于，R2试剂中，5,5; - 二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度为0.05% ; 乙二醇的浓度为5% ； 柠檬酸盐缓冲液的pH值为5.0。
【文档编号】G01N21/31GK104198404SQ201410383545
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】林亮 申请人:福州艾维德生物医药有限公司