一种甲型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 甲型肝炎（以下简称甲肝）是由甲型肝炎病毒（HAV)引起的传染性疾病，甲肝的 临床症状与感染者的年龄有关，6岁以下的儿童，70%的感染都是无症状的在年龄稍大的儿 童和成人中，感染者多显示临床症状，其中大部分病人都会出现黄疸。甲肝病毒的平均潜伏 期是28天，典型的临床症状包括发热、不舒服、厌食、呕吐、腹部不适等，这些症状通常不会 超过2个月。目前尚未有证据表明感染甲肝病毒后会导致慢性肝炎或形成持续性感染，但 有研究表明，15%到20 %的病人会产生较长的病程或者复发，可能会持续长达6个月的时 间。
[0003]HAV属于小RNA病毒科，肝病毒属，无包膜，在世界范围引起广泛的流行。甲肝病毒 主要在肝脏进行复制，产生病毒血症，并通过胆汁分泌到肠道，在病人的粪便中大量存在， 每克粪便中会有高达1〇 9感染性病毒颗粒，故病人排泄的类便是HAV感染的主要感染源，此 外在甲肝病人的唾液中也能检测出甲肝病毒，但病毒载量比血清低1到3个数量级单位。甲 肝病毒感染多为自限性，严重的可形成爆发性肝炎并导致死亡。
[0004] 由于HAV主要通过粪口途径传播，包括人与人的接触和摄取被甲肝患者大便污染 的食物或水。但由于HAV感染具有很长的潜伏期，很难在食物中检测病毒，除非能将食物 保存下来或者有持续的污染，检测由污染食物导致的散发病例就更加困。
[0005] 而目前在临床甲肝诊断的方法中，主要是采用基于实时焚光定量PCR(Polymerase ChainReaction，即聚合酶链式反应）的技术及其改进。实时荧光定量PCR技术是近年来 发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置 能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光 信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获 得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判 断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量 分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少量荧光PCR诊 断试剂盒在HAV诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度不高，检测范 围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的 需要。
[0006] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测甲型肝炎病毒的方法，这些试 剂盒所提供的HAV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法，然而酚-氯仿法和柱提取 法存在很多不足之处：1)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和 人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无 需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差、准确度差；2)无法有效去除样 本中的PCR抑制物3)无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施；5)现有方法 检测灵敏度欠佳，可能出现漏检现象。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法， 以解决【背景技术】所述的现有HAV检测方法准确度差的问题。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括 PCR反应液，且所述PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；
[0010] 所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
[0011] 5 'FAM-CCTGAACCTGCAGGAATTAA-BHQ13 '。
[0012] 优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0013]上游引物：5' -TCACCGCCGTTTGCCTAG-3'；
[0014]下游引物：5 '-GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3'。
[0015] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为插入PUC18T载体的一段长为 128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，且所述128碱基对的序列为：
[0016] 5 ' -GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3'。
[0017] 优选地，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱 基对序列为：
[0018] 5' HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ1 3'。
[0019] 优选地，所述PCR反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上 游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0020]上游引物：5 '-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3' ；
[0021]下游引物：5 '-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3'。
[0022] 优选地，所述DNA聚合酶为1U/ μ 1~5U/ μ 1 Tth DNA聚合酶和1U/ μ 1~5U/ μ 1 H-Taq DNA聚合酶。
[0023] 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00~ 5. 00E+05copies/ml的HAV病毒基因体外转录RNA。
[0024] 优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为阴性人造血清。
[0025] 优选地，所述检测试剂盒还包括RNA洗脱液，所述RNA洗脱液包括0. 8~1. 2mol/ L的Tris-HCl和0· 1~1. Omol/L的EDTA。
[0026] 优选地，所述检测试剂盒还包括RT-PCR增强剂，所述RT-PCR增强剂为浓度是 100~500mmol/L的Mn(0Ac)2。
[0027] 优选地，所述检测试剂盒还包括：
[0028] RNA提取溶液I :由质量/体积比为0. 2%~1. 0%的十二烷基硫酸钠、体积/体积 比为1. 0%~4. 0%的曲拉通，0. 2mol/L~1. Omol/L的异硫氰酸胍、100~400 μ g/ml的磁 珠组成；
[0029]RNA提取溶液II:浓度为100~300mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为 100~300mmol/L的氯化钠；所述RNA提取溶液II的pH为6. 5±0. 2 ;
[0030] RNA提取溶液III:由体积/体积比为0. 1 %~1. 0 %的曲拉通、浓度为100~ 300mmol/L的氯化钠；
[0031]RNA提取溶液IV:矿物油。
[0032] 本发明还提供了一种甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，所述使 用步骤包括：
[0033] S01 :取体积比为1000-1200 :1的RNA提取溶液I和内标，混和均匀并形成RNA提 取试剂I-mix，瞬时离心后备用；
[0034] S02 :取体积比为49:1的PCR反应液和RT-PCR增强剂，混和均匀并形成PCR-mix， 瞬时离心后备用；
[0035]S03 :在灭菌离心管中加入200μ1~1mlRNA提取溶液I-mix，加入100μ1~1ml 待测样本，震荡混匀，瞬时离心后备用；
[0036] S04 :在步骤S03瞬时离心后备用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提取溶液II， 震荡混匀，静置；
[0037] S05 :静置结束后瞬时离心，