并将灭菌离心管置于磁珠分离器上，缓慢将溶液吸出 弃用，磁珠备用；
[0038]S06:在备用的磁珠内加入400μ1~1ml的RNA提取溶液III和100μ1~500μ1 的RNA提取溶液IV，震荡混匀并瞬时离心，然后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上；
[0039] S07 :上清液分为两层，将吸头插入灭菌离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全 吸出丢弃，静置后，将管底残余液体完全吸出丢弃，上清液中的上层液保留备用；
[0040] S08 :在上述保留备用的上清液的上层液中加入10 μ 1~100ul RNA洗脱液，将灭 菌离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，静置后将灭菌离心管再次置于磁珠分离器上，然 后将洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；
[0041] S09 :在八联管中加入45μ1的PCR-mix，并取步骤S08的新的灭菌离心管中已处 理好的样本RNA、阴性对照、阳性对照各5μ1加入到PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
[0042] S10 :将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
[0043] 本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR反应液，且所述 PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷酸的上 游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定 量PCR检测试剂盒能够对人或动物的血清或奠便标本中的HAV进行定量分析，且仅能检测 出HAV的RNA，而不能检测出其它病原体的RNA，进而说明本发明所提供的检测试剂盒具有 很好的特异性。本发明所提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒在提取RNA时使用 吸附效果好、易于纯化的磁珠法，该法能够有效地去除复杂样本中的PCR抑制物，从而获得 高纯度和高得率的RNA，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性。同时，本发明所提供的甲 型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还具有操作快速、方法简便、检测范围宽的特点。
【附图说明】
[0044] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0045]图1是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法流 程不意图；
[0046] 图2是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒中定量 参考品A(5.00E+06copies/ml)、B(5.00E+05copies/ml)、C(5.00E+04copies/ml)和 D(5.00E+03copies/ml)的扩增曲线图；
[0047]图3是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒中定量分析的 标准曲线图；
[0048] 图4是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对HAV不同基 因型的HAV核酸进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图；
[0049] 图5是本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒对正常人血清 样本、或者HBV、HCV、HEV、HIV-1、EBV、HCMV感染样本进行荧光PCR反应测试的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0050] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，解决 了现有HAV检测方法准确度差的问题。
[0051] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实 施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术 方案作进一步详细的说明。
[0052] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括一种PCR反应 液，且该PCR反应液包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、用于扩增靶多核苷 酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。
[0053] 其中，PCR缓冲液为5XPCR缓冲液；脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0. 2mmol/l ; DNA聚合酶包括浓度为1U/ μ 1~5U/ μ 1的Tth DNA聚合酶（Tth DNA polymerase，即耐热 DNA聚合酶）和1U/ μ 1~5U/ μ 1的H_Taq DNA聚合酶（Thermusaquaticus，即Η-耐热DNA 聚合酶）。
[0054] 本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索 到的HAV病毒各型别基因组序列进行同源性比较，找出保守的区段，设计了多对通用引物， 经优化，筛选出了扩增效果相对较好的一对用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物。
[0055]其中，该探针的碱基对序列为：5' FAM-CCTGAACCTGCAGGAATTAA-BHQ1 3'；
[0056] 用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0057]上游引物：5 ' -TCACCGCCGTTTGCCTAG-3 '；
[0058]下游引物：5 ' -GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3'。
[0059] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒由于采用了上述探 针和上下游引物，仅能检测出HAV的RNA，而不能检测出他病原体的RNA，从而说明本发明试 剂盒具有很好的特异性。应用本发明提供的检测试剂盒不仅能够对人或动物血清或是粪便 标本中的HAV进行定量分析，而且操作快速、方法简便、特异性好。
[0060] 本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的PCR反应液进一 步包括内标，即包括阳性内对照，该内标为插入pUC18T载体的一段长为128碱基对的人工 合成DNA序列的重组体，即质粒。在PCR反应体系中，该内标可以监控PCR反应过程，监控 反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性。 其中，该内标的浓度为1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/mlcopies/ml，且该内标的 128喊基对的序列为：
[0061] 5 ' -GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3'。
[0062] 本发明实施例提供的PCR反应液还包括针对128碱基对序列而设计的用于检测内 标的非竞争性探针，该非竞争性探针的的碱基对序列为：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACC ACC-BHQ1 3'。
[0063] 同时，本发明实施例还提供了用于扩增内标的上下游引物，该上下游引物的碱基 对序列为：
[0064]上游引物：5 ' -GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3 ' ；
[0065]下游引物：5 ' -GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3 '。
[0066] 优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阳性 对照，该阳性对照是浓度为1. 00~5. 00E+05copies/ml的HAV病毒基因体外转录RNA。
[0067] 优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括阴性 对照，该阴性对照为阴性人造血清。
[0068] 优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒还包括 RNA洗脱液，该RNA洗脱液包括 0· 8 ~1. 2mol/L的Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl) aminomethane，即三（轻甲基）氨基甲烧盐酸盐）和0· 1~1.Omol/L的EDTA(Ethylene DiamineTetraaceticAcid，即乙二胺四乙酸）。
[0069] 优选地，本发明实施例提供的甲型肝炎病毒荧光定量PCR检测