鉴定柱花草杂交后代真实性的多重pcr引物、方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定柱花草杂交后代真实性的多重PCR 引物、方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 统作物育种过程主要依赖于植株的表型选择（phenotypicselection)，性状选 择效果难以提高。遗传标记特别是基于DNA多态性的分子标记在作物遗传连锁图谱构建、 重要性状基因标记定位与克隆、种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图谱绘制 及遗传纯度检测等方面广泛应用，尤其是分子标记辅助选择（molecularmarker-assisted selection，MAS)为育种工作提供了极大方便，可显著提高育种的选择效率与育种预见性。
[0003]目前，随着分子标记技术的不断发展和广泛应用，国内外在植物杂交育种的后代 鉴定中也越来越多地应用各种分子标记技术，如RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子标记。但RAPD 标记受反应条件的影响较大，重复性差；SSR单个标记提供的信息量较少，引物具有物种特 异性，开发难度也大，成本较高；ISSR标记的扩增条件需要较长时间的摸索，且多为共显性 标记；AFLP标记操作复杂，要求严格，成本高等不足之处。
[0004] 一 种基于PCR的新型分子标记技术 一SRAP(Sequence-relatedAmplified Polymorphism)标记的发明和应用弥补了以上分子标记的不足且具备了它们的优点。此技 术是由美国加里弗尼亚大学，蔬菜系Li和Quiros于2001年在芸薹属植物中开发提出的。 SRAP标记是根据基因外显子中丰富的GC含量和内含子、启动子中丰富的TA含量的特点，利 用独特的引物设计对0RFs(0penreadingframes,开放阅读框架）进行扩增，因不同个体 间的外显子、内含子和启动子的不同而产生多态性。SRAP标记简单、稳定可靠、重复性好、多 态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性、少量引物可组配多种引物对等优点使其在多 种植物中得到广泛的应用。引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。
[0005]目前，多数报道均采用单一SRAP引物对检测柱花草属植物杂交后代的真实性，这 导致每次实验都需要配置不同的体系进行PCR，比如要鉴定100种杂交后代，就要配置至少 100个PCR管，由于鉴定引物不同，DNA样品不同，在配置PCR体系过程中非常麻烦，很容易 加错样品。若提供一种引物组合物，同时可以用于鉴定多种杂交后代真实性，只需要配置一 个PCR体系，再分别添加待检测的杂交后代真DNA，将大大降低工作量，减少人为失误。
[0006] 因此，需要提供一种同时采用多对SRAP引物对鉴定柱花草属植物杂交后代的方 案；目前，还未有报道用于鉴定柱花草属植物杂交后代真实性的多重PCR引物。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明提供了一种鉴定柱花草杂交后代真实性的多重PCR引物、 方法及试剂盒。本发明提供的柱花草杂交后代真实性的分子鉴定方法，为针对柱花草杂交 后代进行SRAP分子标记鉴定，快速、准确。
[0008] 第一方面，本发明提供了一种鉴定柱花草杂交后代真实性的多重PCR引物，包括 如下a)-d)引物对的两对或三对：
[0009]a).引物对MelEm8:
[0010]正向引物 5 ' -TGAGTCCAAACCGGATA-3 '，反向引物 5' -GACTGCGTACGAATTCAA-3' ；
[0011] b).引物对Me3Em3:
[0012] 正向引物 5 ' -TGAGTCCAAACCGGAAT-3 '，反向引物 5' -GACTGCGTACGAATTGAC-3' ；
[0013] b).引物对Me4Em2:
[0014]正向引物 5' -TGAGTCCAAACCGGACC-3'，反向引物 5' -GACTGCGTACGAATTTGC-3'。
[0015] 第二方面，本发明还提供了一种鉴定柱花草杂交后代真实性的多重PCR方法，为 用如第一方面所述的多重PCR引物扩增待鉴定的柱花草杂交后代的基因组DNA，其中，多重 PCR体系中，DNA模板用量为50-200ng、Mg2+浓度为2. 8mmol/L、引物总浓度为0· 9μπιο?/ L(每对引物各0. 2ymol/L，每条引物等量添加）、dNTP浓度为0. 25mmol/L、Taq酶用量为 lU〇
[0016] 优选地，多重PCR扩增反应条件为：
[0019] 第三方面，本发明还提供了一种鉴定柱花草杂交后代真实性的试剂盒，包括如第 一方面所述的多重PCR引物，还包括用于多重PCR的缓冲液、DNA聚合酶。
[0020] 第四方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的多重PCR引物在鉴定柱花草杂 交后代真实性中的应用。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明人经过反复验证、筛选，获得了多对鉴定柱花草杂交后代真实性的SRAP引 物对，但在研究中发现，针对同一株杂交后代，不同的SRAP引物对的鉴定结果不一致，为了 提高鉴定准确度，需要进行多组平行试验，工作量很大。经过本发明人深入研究，经过多次 实验，获得了适合多对SRAP引物对同时PCR的多重PCR体系，大大降低了工作量，在保证检 测灵敏度及准确度的前提下，节省了试剂成本，降低了样品用量，得到的条带清晰、多态性 好、重复性高，可有效应用于柱花草杂种真实性的鉴定和遗传分析。
【附图说明】
[0023] 图1是采用第1-10个引物组合对4号杂交组合亲本材料DNA的多态性的琼脂糖 凝胶电泳检验结果；
[0024] 图2是本发明实施例提供的xxxxDNA琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明采用的Mg2+、 dNTPs、TaqDNA聚合酶和用于凝胶检测的标准分子量DNAMarker均购自北京天根有限公 司。
[0026] 本发明实验材料、试剂如下：
[0027] 1、本发明实施例采用的柱花草亲本材料（表1)及其84份杂交后代（表2)，均种 植于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草中心中种质圃。
[0028] 表1柱花草杂交组合的亲本名称及来源
[0030] 表2柱花草杂交组合及其后代
[0031]
[0032] 2、本发明实施例的SRAP引物设计合成参考Li和Quiros(2001)的方法，引物由上 海英俊生物科技有限公司合成，序列如表3所示。
[0033] 表3所用SRAP引物序列
[0034]
[0036] 实施例1柱花草SRAP分子标记引物筛选
[0037] 亲本杂交：柱花草为自花授粉植物，人工去雄困难。本研究经过多年田间试验发 现柱花草雄性不育材料，以雄性不育柱花草材料为母本，选取性状良好的父本材料采用人 工授粉，授粉后套袋，种子成熟后收种，将种子用温水处理后育于营养袋中，4周后随即选取 84个单株进行SRAP鉴定。
[0038] 参照（HuangC.Q.，2010)提取方法，提取新鲜幼嫩叶片的DNA，紫外分光光度计及 1. 5 %琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度，并稀释到50ng/μL备用。
[0039] 应用杂交亲本材料对表3的39对SRAP引物组合进行筛选，从中获得具有扩增条 带清晰、丰富的父本特征性条带的引物组合，用于杂交后代的真实性鉴定，每一个引物组合 重复实验一次。
[0040]PCR扩增体系为：总体积 10yL，2XEcoTaqPCRSuperMix5yL，引物各 0· 5μL(10μmol/L)，DNA1μL(50ng/μL)，3μLddH20〇
[0041]PCR扩增程序：94°C预变性 4min，94°C变性lmin，35°C复性lmin，72°C延伸 30s，共 5个循环；然后，94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；循环结束后， 72°C延伸lOmin;4°C停止反应。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0042] 应用分子标记技术对杂种后代进行真