一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法
【专利摘要】本发明公开一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，包括非洲菊的花托外植体预处理、接种及诱导培养、转移诱导培养、幼苗的驯化与炼苗等步骤，培育出非洲菊脱毒幼苗。本发明涉及的非洲菊脱毒幼苗的培育方法，避免在培育过程中受病毒、病害因素的干扰，提高愈伤组织的形成数量与效率，培养周期短，提高幼苗成苗率，在非洲菊组培领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】
_种非洲菊脱毒幼苗的培育方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，尤其涉及一种基于非洲菊花托外植体培育脱毒幼苗的方法。
【背景技术】
[0002]非洲菊是菊科大丁草属的多年生宿根常绿草本花卉，为世界五大切花之一，因其花大、花艳、花色全且瓶插寿命长，深受人们欢迎，在我国种植范围广泛。
[0003]由于非洲菊大多自交不孕，杂交后代会分裂和变异，遗传信息从亲代传给后代时由于栽培环境如光照、水分、温度、营养等原因会导致非洲菊的品种退化，失去原有的典型性，通常表现为花朵变小、过渡色多、花形紊乱、花杆变细、抗性降低、花期缩短等。
[0004]现有技术中，非洲菊的一种常规繁殖方法是采用分株法，但其繁殖系数低，不能满足大规模生产的需要，而且由于培养温度、增殖芽的继代代数以及激素浓度等因素易造成非洲菊种苗发生无性变异。
[0005]为迅速获得大量品质优良的无病、无毒非洲菊种苗，利用组织培养技术开展非洲菊种苗生产是一种有效的途径。组织培养技术在生产中包括两个阶段:室内培养和室外扦插培养，室内培养主要是利用组织诱导培养、增殖培养以及重要培养，而室外主要是将室内生根的组织诱导幼苗置于室外驯化和移栽培育成活。现有技术中非洲菊的组培方法在室内培养时存在组织诱导率低、诱导苗质量差且多弱苗等问题，而室外扦插培养过程中也存在幼苗增殖效率低、幼苗移栽成活率低等问题。
【发明内容】
[0006]基于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，是一种基于非洲菊花托外植体培育脱毒幼苗的方法，避免受病毒、病害因素的干扰，且培养周期短，成功率高。
[0007]具体步骤如下:
[0008](I)花托外植体预处理:
[0009]选取直径I?2cm的花蕾，在4°C环境中冷藏3?5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去荀片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升萊水溶液中消毒5?8min，再用70 %的酒精消毒20?40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
[0010]以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0011](2)外植体接种及诱导培养:
[0012]将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1°C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400?800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
[0013]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2P04 300?450mg/L，CaCl2.2出0 320?350mg/L，MgS04.7出0 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeS04.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H2015?30mg/L，H3B03 8?10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H20 I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4-鹏苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?I.0mg/L，维生素BI 0.5?0.7511^/1，维生素86 1.0?1.5mg/L，烟酸1.0?1.5mg/L，蔗糖30?50g/L，琼脂 10?15g/L，激动素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，盐酸卩比卩多醇0.5?1.0mg/L，盐酸硫胺素0.5?I.0mg/L，甲基亚硝基脲1.5?2.0mg/L,卩引噪丁酸I.5?2.0mg/L，丙氨酸5?I Omg/L，叶酸5?I Omg/L，调环酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙碱I.5?2.0mg/L，水解蛋白2.0?2.5g/L。
[0014](3)转移诱导培养:
[0015]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成非洲菊幼苗。
[0016]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0017]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0018](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0019]将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0020]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10?15天。
[0021]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5?1.5:0.2?0.8:0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?
0.15:0.005?0.015，优选质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0022]本发明涉及的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，具有以下技术效果:
[0023]1、对非洲菊的花托外植体采用冷藏消毒、复合消毒的方法，能有效减少诱导培养过程中受细菌污染的概率。
[0024]2、诱导愈伤组织阶段用分段培养的方法，先采用蓝光照射再采用荧光照射，二者的结合大大缩短了愈伤组织的愈伤分化时间，提高了愈伤组织的形成数量与效率。
[0025]3、本发明还提供了愈伤组织诱导培养的培养基，为非洲菊愈伤组织的诱导培养过程提供科学合理的营养，提高幼苗成苗率，本发明的非洲菊幼苗平均成苗率达到92.4%。
[0026]本发明不仅减少了非洲菊脱毒幼苗的培育周期，还提高了幼苗成苗率，在非洲菊组培领域具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0027]下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0028]实施例1
[0029]—种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，具体步骤如下:
[0030](I)花托外植体预处理:
[0031]选取直径I?2cm的花蕾，在4°C环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒5min，再用70%的酒精消毒30s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
[0032](2)外植体接种及诱导培养:
[0033]将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1°C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为600Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
[0034]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L,CaCl2.2H20 340mg/L,MgSO4.7H20 190mg/L，EDTA 150mg/L,FeSO4.7H2040mg/L,MnSO4.4H20 60mg/L,ZnSO4.7H20 20mg/L,H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L,Na2MoO4.2H203mg/L，CoCl2.6H2O 0.3mg/L，4_碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，维生素BI 0.65mg/L，维生素B6 I.3mg/L，烟酸I.lmg/L，鹿糖40g/L，琼脂 12g/L，激动素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，盐酸卩比卩多醇0.8mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，甲基亚硝基脲1.6mg/L，卩引噪丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，叶酸8mg/L，调环酸I丐1.7mg/L，秋水仙碱1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。
[0035](3)转移诱导培养:
[0036]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成非洲菊幼苗；
[0037]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸
0.5?2.0mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0038]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0039](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0040]将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1°C，光照强度每天增加300Lx，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中。
[0041]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，其质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0042]实施例2
[0043]—种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，具体步骤如下:
[0044](I)花托外植体预处理:选取直径I?2cm的花蕾，在4 °C环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05 %的升汞水溶液中消毒5min，再用70%的酒精消毒20s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0045](2)外植体接种及诱导培养:将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1°C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
[0046]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L,CaCl2.2H20 320mg/L,MgSO4.7H20 180mg/L，EDTA 120mg/L,FeS04.7H2030mg/L，MnS04.4H2O 50mg/L，ZnS04.7H2O 15mg/L，H3B03 8mg/L，KI 5mg/L，Na2Mo04.2H2Olmg/L，CoCl2.6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，维生素BI 0.511^凡，维生素136 1.011^凡，烟酸1.011^凡，鹿糖3(^凡，琼脂1(^凡，激动素0 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，盐酸卩比卩多醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甲基亚硝基脲1.5mg/L，卩引噪丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，叶酸5mg/L，调环酸I丐1.5mg/L，秋水仙碱1.5mg/L，水解蛋白2.0g/L。
[0047](3)转移诱导培养:将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27 ± I°C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成非洲菊幼苗。
[0048]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸
0.5mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了 6-苄氨基嘌呤1.5mg/L。
[0049](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0050]将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0051 ]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1.5°C，光照强度每天增加400Lx，至与外部环境相同时，再培养2天即可移栽至普通土壤中。
[0052]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1: 0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005 O
[0053]实施例3
[0054]一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，具体步骤如下:
[0055](I)花托外植体预处理:
[0056]选取直径2cm的花蕾，在4°C环境中冷藏5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒8min，再用70%的酒精消毒40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
[0057]以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0058](2)外植体接种及诱导培养:
[0059]将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1°C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
[0060]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L,CaCl2.2H20 350mg/L,MgSO4.7H20 240mg/L，EDTA 180mg/L,FeSO4.7H2050mg/L，MnS04.4H2O 80mg/L，ZnS04.7H2O 30mg/L，H3B03 I Omg/L,KI 10mg/L，Na2Mo04.2H2O 5mg/L，CoCl2.6H2O 0.5mg/L，4_碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，维生素BI 0.75mg/L，维生素B6 I.5mg/L，烟酸I.5mg/L，蔗糖50g/L，琼脂15g/L，激动素KT
1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，盐酸卩比卩多醇1.0mg/L，盐酸硫胺素I.0mg/L，甲基亚硝基脲2.0mg/L，卩引噪丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，叶酸10mg/L，调环酸钙2.0mg/L，秋水仙碱2.0mg/L，水解蛋白2.5g/L。
[0061 ] (3)转移诱导培养:
[0062]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成非洲菊幼苗；
[0063]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸
2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
[0064]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤2.0mg/Lο
[0065](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0066]将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0067]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续15天。
[0068]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩100g、蛭石150g、锯末80g、松树皮80g、水苔50g、花泥15g、泥炭土 15g以及钙镁磷钾肥1.5g。
【主权项】
1.一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)花托外植体预处理: 选取直径I?2cm的花蕾，在4 °C环境中冷藏3?5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05 %的升汞水溶液中消毒5?8min，再用70 %的酒精消毒20?40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体，以上涉及的百分比均为体积百分比； (2)外植体接种及诱导培养: 将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23± 10C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400?800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织； (3)转移诱导培养: 将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27 ± TC，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成非洲菊幼苗； (4)幼苗的驯化与炼苗: 将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。2.根据权利要求1所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:步骤(2)所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2PO4 300?450mg/L，CaCl2.2H20 320?350mg/L，MgS04.7H20 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeS04.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H20 15?30mg/L，H3BO3 8?10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H2O I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4_鹏苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?I.0mg/L，维生素BI 0.5?0.75mg/L，维生素B6 1.0?I.5mg/L，烟酸 1.0?1.5mg/L，鹿糖30?50g/L，琼脂 10?15g/L，激动素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，盐酸卩比卩多醇0.5?I.0mg/L，盐酸硫胺素0.5?I.0mg/L,甲基亚硝基脲I.5?2.0mg/L，卩引噪丁酸I.5?2.0mg/L，丙氨酸5?10mg/L，叶酸5?10mg/L，调环酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙碱I.5?2.0mg/L，水解蛋白2.0?2.5g/L。3.根据权利要求1或2所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L; 所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了 6-苄氨基嘌呤1.5?2.0mg/Lο4.根据权利要求1所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:步骤(4)所述逐步转移到外部环境中的方法为:将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10?15天。5.根据权利要求1所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:步骤(4)所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥。6.根据权利要求5所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述炼苗基质中，珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土、钙镁磷钾肥的质量比为1: 0.5?1.5:0.2?0.8:0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?0.15:0.005?0.015。7.根据权利要求6所述的一种非洲菊脱毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述炼苗基质中，珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土、钙镁磷钾肥的质量比为1: 1: 0.5:0.5:.0.3:0.1:0.1:0.01ο
【文档编号】A01H4/00GK106069767SQ201610493769
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】许建中, 林少会, 孟剑华
【申请人】无锡南理工科技发展有限公司