一种牛耳枫组织培养方法
【专利摘要】本发明提供了一种牛耳枫组织培养方法，包括以下步骤：消毒处理、初代培养、继代培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽。本发明的方法用于牛耳枫的组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
【专利说明】
一种牛耳枫组织培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种牛耳楓组织培养方法。
【背景技术】
[0002] 牛耳楓(拉丁学名：Daphniphyllum calycinum Benth.)别称:铃猪肚、猪肚果、猪 肚木、猪肚子、猪洛木、猪络木、猪仔木、珠碌子、山羊屎、羊屎子、老虎耳、土鸦胆子、大耳梳、 南岭虎楠、南岭虎皮楠及岭南虎皮楠。其为虎皮楠科虎皮楠属植物，常绿灌木或小乔木植 物，高约1~6米，小枝灰褐色，具稀疏的皮孔及叶痕，直径约3~5毫米。产广西、广东、福建、 江西等省区；生于海拔250~700米的疏林或灌丛中，在越南和日本也有分布。
[0003] 牛耳楓种子榨油可制肥皂或作润滑油，而且其种子可治慢性痢疾（《南宁市药物 志》）；其枝叶具有祛风止痛、解毒消肿的作用，主风湿骨痛、疮疡肿毒、跌打骨折、毒蛇咬伤 等(《陆川本草》:驱风，止痛，消肿。治风湿骨痛，浮肿;《南宁市药物志》:治跌打后遗筋缩）； 其根具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛的作用，主外感发热、咳嗽、咽喉肿痛、胁下痞块、风 湿骨痛、跌打损伤。牛耳楓具有很高的医用价值，研究者们对其的研究也越来越多。例如 CN102988565A、CN102698204A、CN102258583A等多篇专利文献均公开了含有牛耳楓的药物 制剂，而且市场上已出现牛耳楓与辣寥配伍的楓寥肠胃康颗粒，用于急性胃肠炎，属伤食泄 泻型及湿热泄泻型者，症见腹痛腹满、泄泻臭秽、恶心呕腐或有发热恶寒苔黄脉数等，亦可 用于食滞胃痛而症见胃脘痛、拒按、恶食欲吐、嗳腐吞酸、舌苔厚腻或黄腻脉滑数者。可以预 期牛耳楓的应用将会越来越广泛。
[0004] 但是目前关于牛耳楓种子萌发和培养技术的研究极少。由于牛耳楓种子的发芽率 普遍较低，采用常规的种子繁殖方法速度慢。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大， 繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，已广泛应用各种 观赏植物中，目前尚未见有应用于牛耳楓上。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种牛耳楓组织培养方法，解决了牛耳楓因种子发芽率较低 而繁殖速度慢的问题。本发明的方法用于牛耳楓快速繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系数大， 繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
[0006] 本发明的第一个方面是提供一种牛耳楓组织培养方法，包括以下步骤：
[0007] (1)消毒处理:选用成熟、饱满、无病虫害的牛耳楓种子，去皮，清洗，消毒；
[0008] (2)初代培养:将步骤（1)处理后的外植体切开，剥取完整胚接种到初代培养基中 培养，得到无菌小苗，其中，所述初代培养基为添加有0.1~l.〇mg/L的6-BA和0.05~O.lmg/ L的NAA的MS培养基；
[0009] (3)继代培养:无菌小苗切去根部后转接入继代培养基中培养30~35d，其中，所述 继代培养基为添加有1. 〇~2. Omg/L的6-BA和0.1~0.5mg/L的NAA的WPM培养基；
[0010] (4)壮苗培养:将分化的小苗转接到壮苗培养基中培养25~35d，其中，所述壮苗培 养基为添加有Ο · 1~1 .〇mg/L的6_BA、0 · 01~Ο · lmg/L的NAA、20~40g/L的鹿糖和5~8g/L卡 拉胶的MS培养基；
[0011] (5)生根培养:将小苗切成单株，接种至生根培养基中诱导根的发育，得到生根苗， 其中，所述生根培养基为添加有1.0~5. Omg/L的ΙΒΑ、0.5~3. Omg/LNAA和20~40g/L蔗糖的 1/2MS培养基；
[0012] (6)炼苗及移栽：生根苗置于室温下经7~10d的自然光炼苗，然后洗净根部培养 基，移栽。
[0013] 优选地，步骤（2)中所述初代培养基为添加有0.5~1. Omg/L的6-BA和0.05~ 0 · lmg/L的NAA的MS培养基。
[0014] 进一步优选地，步骤(2)中所述初代培养基为添加有l.Omg/1的6-BA和O.lmg/1的 NAA的MS培养基。
[0015] 优选地，步骤(3)中所述继代培养基为添加有1 · 〇~2 · 0mg/L的6-BA和0 · 1~0 · 2mg/ L的NAA的WPM培养基。
[0016] 进一步优选地，步骤(3)中所述继代培养基为添加有2.0mg//L的6-BA和0.2mg//L的 NAA的WPM培养基。
[0017] 优选地，步骤(4)中所述壮苗培养基为添加有0 · 5mg/L的6-BA、0 · 05的NAA、30g/L的 蔗糖和6g/L卡拉胶的MS培养基。
[0018] 优选地，步骤(5)中所述生根培养基为添加有3 · 0mg/L的IBA、1 · Omg/LNAA和25g/L 蔗糖的1/2MS培养基。
[0019] 其中，步骤(2)中培养条件为:培养温度25~27°C，光强1300-1500LUX，每天光照9 ~10h〇
[0020] 其中，步骤(3)和步骤中培养条件为:培养温度25~27°C，光强1700-2000LUX，每天 光照9~10h。
[0021] 其中，步骤(4)中培养条件为:培养温度25~27°C，光强1700-2000Lux，每天光照9 ~10h〇
[0022] 其中，其特征在于，步骤（5)中培养条件为：培养温度27~29 °C，光强1800~ 2200Lux，每天光照11~12h。
[0023] 其中，步骤（1)中清洗可以采用种子组织培养中常用的清洗方法。作为本发明的一 个优选实施方式，步骤（1)中清洗为:先用水清洗干净，再用〇. 5~5wt %的洗衣粉或洗洁精 的水溶液浸泡5~10m i η，然后用水冲洗。
[0024] 其中，步骤（1)中消毒可以采用种子组织培养中常用的消毒方法。作为本发明的一 个优选实施方式，步骤(1)中消毒为:酒精消毒、升汞消毒、无菌水漂洗。
[0025] 本发明的第二个方面是提供一种用于牛耳楓组织培养的培养基组，所述培养基组 包括初代培养基、和/或继代培养基、和/或壮苗培养基、和/或生根培养基，其中，所述初代 培养基为添加有〇. 1~1. 〇mg/L的6-ΒΑ和0.05~0. lmg/1的ΝΑΑ的MS培养基;所述继代培养基 为添加有1. 〇~2.0mg/L的6-BA和0.1~0.5mg/L的NAA的WPM培养基;所述壮苗培养基为添加 有0 · 1~1 · 0mg/L的6-BA、0 · 01~0 · lmg/L的NAA、20~40g/L的蔗糖和5~8g/L卡拉胶的MS培 养基;所述生根培养基为添加有1 · 〇~5 · 0mg/L的ΙΒΑ、0 · 5~3 · Omg/LNAA和20~40g/L蔗糖的 1/2MS培养基。
[0026] 优选地，所述初代培养基为添加有0 · 5~1 · Omg/L的6-BA和0 · 05~0 · lmg/L的NAA的 MS培养基。
[0027]进一步优选地，所述初代培养基为添加有1 .Omg/1的6-BA和0 . lmg/1的NAA的MS培 养基。
[0028] 优选地，所述继代培养基为添加有1 · 0~2 · Omg/L的6-BA和0 · 1~0 · 2mg/L的NAA的 WPM培养基。
[0029] 进一步优选地，所述继代培养基为添加有2. Omg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA的WPM培 养基。
[0030] 优选地，所述壮苗培养基为添加有〇.5mg/L的6-ΒΑ、0·05的NAA、30g/L的蔗糖和6g/ L卡拉胶的MS培养基。
[0031] 优选地，所述生根培养基为添加有3 . Omg/L的IBA、1. Omg/LNAA和25g/L蔗糖的1/ 2MS培养基。
[0032] 本发明的方法用于牛耳楓组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐 一致，移栽成活率高的优点。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
[0034] (1)消毒处理
[0035]以成熟、饱满、无病虫害的新鲜的成熟种子为外植体，将其剥去果皮并清洗干净， 用2%左右的洗衣粉或洗洁精的水溶液浸泡5~10min，然后流水冲洗lh左右。在超净工作台 上用75%酒精进行浸泡消毒30~60s，再用0.1 %升汞消毒10~12min，然后用无菌水漂洗数 遍洗去消毒液备用。
[0036] (2)初代培养
[0037] 将消毒好的外植体切开，剥取完整胚接种到不同的初代培养基（添加不同量的6-BA和NAA的MS培养基，具体见表1)中，于培养温度26 ± 1°C，光强1300-1500Lux的培养室中进 行培养，每天光照9~10h。培养30d后得到无菌小苗。其发育、生长情况见表1。
[0038] 表1不同培养基条件下牛耳楓胚的发育、生长情况
[0039]
[0040]
[0041] 结果表明，牛耳楓成熟胚培养出的小苗比幼胚培养出的小苗要健壮，较容易成活， 因此牛耳楓胚培养应选择成熟果实中的胚为材料。其初代培养最适培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+O.lmg/L NAA〇
[0042] (3)继代培养
[0043] 无菌小苗切去根部后转接入不同的继代培养基(具体见表2)中，于温度26±1°C的 培养室中诱导芽的分化并进行继代增殖培养，每日光照9~10h，光强1700-2000Lu X<330~ 35d继代一次。牛耳楓芽的分化和生长情况见表2。
[0044] 表2牛耳楓芽的分化和生长情况
[0045]
[0046] 从表2可以看出，牛耳楓增殖芽在本发明的继代培养基中分化良好，尤其是在WPM+ 6-BA2.0mg/L+NAA0.2m g//L培养基中分化率最高，芽长势最好，是较为适宜其生长和增殖的 培养基。
[0047] (4)壮苗培养
[0048]将分化的小苗转接到不同壮苗培养基中培养，培养条件:温度26±1°C，每日光照9 ~l〇h，光强度为1700-2000Lux。连续培养30天。结果为：最佳培养基为MS+0. Smg/l的6-BA+ 0.05mg/L的NAA+30/L蔗糖+6.0g/L卡拉胶，采用本发明的其他壮苗培养基培养效果良好。 [0049] (5)生根培养
[0050]将经过壮苗培养的小苗切成单株，接种至不同浓度的生根培养基中诱导根的发 育。培养条件:温度28 ± 1°C，光强2000LUX，每日光照11~12h。
[0051 ] 结果为：最佳培养基为1/2MS+1 · 5mg/LIBA+l · 0mg/LNAA+25g/L蔗糖，根系健壮，生 根率为78.9%生根时间需要30~40天。采用本发明的其他生根培养基培养也能形成健壮根 系，生根率也都达到70 %以上。
[0052] (6)炼苗及移栽：
[0053] 生根苗置于室温下经7~10d的自然光炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中， 移栽基质为腐熟的椰糠加少量河沙。在大棚育苗2~3个月，再移栽入大田定植。其生长良 好，成活率100 %。
[0054] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种牛耳楓组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 消毒处理:选用成熟、饱满、无病虫害的牛耳楓种子，去皮，清洗，消毒； (2) 初代培养:将步骤（1)处理后的外植体切开，剥取完整胚接种到初代培养基中培养， 得到无菌小苗，其中，所述初代培养基为添加有0.1~1. Omg/1的6-BA和0.05~0. lmg/1的 NAA的MS培养基； (3) 继代培养:无菌小苗切去根部后转接入继代培养基中培养30~35d，其中，所述继代 培养基为添加有1. 〇~2. Omg/L的6-BA和0.1~0.5mg/L的NAA的WPM培养基； (4) 壮苗培养:将分化的小苗转接到壮苗培养基中培养25~35d，其中，所述壮苗培养基 为添加有〇· 1~1 .Omg/L的6_BA、0.01~0· lmg/L的NAA、20~40g/L的鹿糖和5~8g/L卡拉胶 的MS培养基； (5) 生根培养:将小苗切成单株，接种至生根培养基中诱导根的发育，得到生根苗，其 中，所述生根培养基为添加有1.0~5. Omg/1的ΙΒΑ、0.5~3. Omg/LNAA和20~40g//L蔗糖的1/ 2MS培养基； (6) 炼苗及移栽:生根苗置于室温下经7~10d的自然光炼苗，然后洗净根部培养基，移 栽。2. 根据权利要求1所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述初代培养 基为添加有〇 · 5~1 · Omg/L的6-BA和0 · 05~0 · lmg/L的NAA的MS培养基。3. 根据权利要求2所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述初代培养 基为添加有1. 〇mg/L的6-BA和0. lmg/L的NAA的MS培养基。4. 根据权利要求1所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述继代培养 基为添加有1 · 〇~2 · 0mg/L的6-BA和0 · 1~0 · 2mg/L的NAA的WPM培养基。5. 根据权利要求4所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述继代培养 基为添加有2.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA的WPM培养基。6. 根据权利要求1所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述壮苗培养 基为添加有〇. 5mg/L的6-BA、0.05的NAA、30g/L的蔗糖和6g/L卡拉胶的MS培养基。7. 根据权利要求1所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(5)中所述生根培养 基为添加有3 · 0mg/L的IBA、1 · Omg/LNAA和25g/L蔗糖的1/2MS培养基。8. 根据权利要求1所述的牛耳楓组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中培养条件为:培 养温度25~27°C，光强1300-1500Lux，每天光照9~10h;步骤(3)和步骤中培养条件为:培养 温度25~27°C，光强1700-2000Lux，每天光照9~10h;步骤(4)中培养条件为:培养温度25~ 27°C，光强1700-2000Lux，每天光照9~10h;步骤(5)中培养条件为:培养温度27~29°C，光 强1800~2200Lux，每天光照11~12h。9. 一种用于牛耳楓组织培养的培养基组，其特征在于，所述培养基组包括初代培养基、 和/或继代培养基、和/或壮苗培养基、和/或生根培养基，其中， 所述初代培养基为添加有〇. 1~1. 〇mg/L的6-BA和0.05~0. lmg/L的NAA的MS培养基； 所述继代培养基为添加有1. 〇~2.0mg/L的6-BA和0.1~0.5mg/L的NAA的WPM培养基； 所述壮苗培养基为添加有〇. 1~1. Omg/1的6-BA、0.01~0. lmg/L的NAA、20~40g//L的蔗 糖和5~8g/L卡拉胶的MS培养基； 所述生根培养基为添加有1.0~5. Omg/1的ΙΒΑ、0.5~3. Omg/LNAA和20~40g//L蔗糖的 1/2MS培养基。10.根据权利要求9所述的培养基组，其特征在于，所述初代培养基为添加有0.5~ 1 · Omg/L的6-BA和0 · 05~0 · lmg/L的NAA的MS培养基； 所述继代培养基为添加有1. 〇~2. Omg/L的6-BA和0.1~0.2mg/L的NAA的WPM培养基； 所述壮苗培养基为添加有〇.5mg/L的6-BA、0.05的NAA、30g/L的蔗糖和6g/L卡拉胶的MS 培养基； 所述生根培养基为添加有3. Omg/L的IBA、1. Omg/LNAA和25g/L蔗糖的1/2MS培养基。
【文档编号】A01H4/00GK106069757SQ201610440880
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】陈媚, 韩丽娜, 唐跃东, 李敬阳, 覃和业, 郭庆辉, 刘以道
【申请人】热作两院种苗组培中心