甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于甘蔗脱毒健康种苗快繁生产技术领域，尤其涉及一种甘蔗脱毒健康种 苗无菌外植体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 甘蔗脱毒健康种苗一般指通过生物技术手段而获得的不携带甘蔗宿根矮化病和 甘蔗花叶病病原物（以下简称病原物）的甘蔗种苗，其常规技术流程如下：病原物的去除- 无菌外植体的建立-丛生芽的诱导-病原检测-健康种苗增殖快繁-生根培养-一级苗 圃沙床假植-二级苗圃营养杯假植-大田一级种苗田扩繁-病原检测-合格种苗大田二 级种苗田扩繁-病原检测-合格种苗大田三级种苗田扩繁-病原检测-合格种苗，合格种 苗即可作为生产用种。在抗甘蔗宿根矮化病和甘蔗花叶病的甘蔗优良新品种面世之前，甘 蔗脱毒健康种苗的应用将始终是一项防治甘蔗病原物最为实用和有效的方法，也是世界上 各个甘蔗种植国家都在进行研究和利用的技术措施。
[0003] 从上述技术流程可看出，要培育出合格的甘蔗脱毒健康种苗，无菌外植体的的制 备是整个培养过程的关键环节，也是实现工厂化育苗的前提。陈仲华等通过热水处理结合 心叶愈伤组织培养，从而建立了一种甘蔗脱毒健康种苗快繁体系，该体系的外植体的制备 步骤与常规植物组培外植体的制备步骤基本相同，其过程必须使用到消毒剂氯化汞等。杨 本鹏等通过热水处理结合1~2mm的茎尖培养的建立了另一种甘蔗脱毒健康种苗培养体系， 其外植体的制备过程同样使用到氯化汞。目前，甘蔗脱毒健康种苗外植体的制备阶段的方 法与上述两种方法大同小异。发明人通过多年实践，认为上述两种外植体的制备方法存在 如下缺陷：第一种方法的心叶愈伤组织培养出的后代种苗易产生变异，不利于种苗质量稳 定;第二种方法以1~2mm大小的莖尖作为外植体，取材难度较大，对技术要求较高，且后续 的诱导培养极易出现消毒剂药害及酚类褐化死亡现象，取材及诱导培养成功率较低；同时， 两种方法均使用到氯化汞进行外植体消毒，若操作过程处理不当，对操作人员的健康及生 态环境均存在潜在不利影响。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种生态、环保且简便易行的甘蔗脱毒健康种苗 无菌外植体的制备方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体 的制备方法，取生长健壮、无病虫为害的植株分割成单芽段，置于52°C温汤中恒温浸泡2h后 种植于无菌种源圃；5~7个月后，连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌 操作切取茎尖端作为无菌外植体。
[0006]上述甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，按以下技术流程进行:熟期甘蔗 大田-选取生长健壮、无病虫为害的植株-单芽段-52°C温汤浸泡2h-无菌种源圃种植5 ~7个月-病原物检测-连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部-去除外部包裹的 4~5片叶鞘后移至接种室-在超净工作台上每去除一片叶鞘，用75%酒精对外植体基部往 尾部擦拭一遍直至露出茎尖端-切取茎尖端0.5~lcm左右的组织接种于外植体培养基上 -其它步骤同常规培养。
[0007] 无菌种源圃为防虫网包围在棚架结构四周形成的与外界隔绝的封闭空间，其目的 在于防止病虫对种源圃内培养的植株感染。
[0008] 防虫网规格为60目。
[0009] 棚架结构高为4~6m，采用竹竿、塑料管或不锈钢管制作。
[0010] 针对目前甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体制备存在取材困难和消毒隐患等问题，发 明人建立了一种甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，取生长健壮、无病虫为害的植 株分割成单芽段，置于52°c温汤中恒温浸泡2h后种植于无菌种源圃；5~7个月后，连续晴天 3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌操作切取茎尖端作为无菌外植体。本发明 与常规的外建方法最大的区别在于省去了氯化汞消毒步骤，原因在于:首先，甘蔗梢部本身 由层层紧密包裹的叶鞘组成，包裹在其中的茎尖端自然处于无菌状态，只要取材过程进行 常规的无菌操作，避免使用带菌的器械接触到茎尖端组织，即可取得无菌外植体;另外，由 于单芽段经过52°C温汤浸泡2h，已彻底去除了其中的病原物，因此，只要后续的生长过程不 被病原物再次浸染即可获得无病原物的植株，其取材的大小跟去除病原物已无关，因此可 以取较大的茎尖作为外植体。本发明生态、环保且简便易行，为甘蔗脱毒健康苗规模化生产 提供了无菌外植体取材的好方法。应用本发明可以降低技术操作门槛，省去外植体消毒环 节，使生产过程较为生态和环保且可以工厂化培育出质量稳定，无变异的甘蔗脱毒健康种 苗；同时，取材的甘蔗外植体更有利于后续阶段的培养，也有利于培育质量稳定的后代种苗 且易于实现规模化生产。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实例具体说明本发明甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法的内容。 为佐证本发明的技术效果，按前述陈仲华(常规方法1)和杨本鹏(常规方法2)的方法进行平 行试验。
[0012] -、培养无病原物植株
[0013] 无菌种源圃的搭建:根据拟种植种茎的数量，测算出常规种植占用的土地面积，此 面积即为无菌种源圃的占地面积。在田间根据地块形状测量出相应的长和宽并做好标记， 用竹竿、塑料管或不锈钢管等在标记好的地块内搭建高4~6m的棚架结构，在棚架结构四周 用60目防虫网包围形成的与外界隔绝的封闭空间，以防止病虫对种源圃内培养的植株感 染，至此无菌种源圃建成。
[0014] 种植材料处理：以新台糖22号为供试材料，于每年10月份开始在甘蔗生产大田中， 砍取生长健壮，无病虫为害的植株，分割成单芽段后置于52°C温汤中恒温浸泡2h后种植于 上述无菌种源圃中，其他管理同常规大田。
[0015] 二、无菌外植体的制备
[0016] 培育：上述经过温汤处理的新台糖22号种茎在无菌种源圃中生长5~7个月后，已 长成具备7~10个有效芽左右的植株，此时正是生长旺盛期，是外植体取材的好时期。
[0017] 病原物检测：对无菌种源圃中的新台糖22号甘蔗植株进行抽样检测，主要检测有 无感染/携带甘蔗宿根矮化病（lxx)、甘蔗花叶病毒(SCMV)和高粱花叶病毒/SrMV)。检测标 准可参照中华人民共和国农业部甘蔗种苗标准(NY/T 1796-2009)和甘蔗花叶病毒检测技 术规范(NY/T 1804-2009)。
[0018] 取材:经检测无感染/携带甘蔗宿根矮化病（lxx)、甘蔗花叶病毒(SCMV)和高粱花 叶病毒/SrMV)的甘蔗植株，于连续3天以上干旱无雨时砍取植株的稍部，在田间逐层去除稍 部叶鞘4~5层，转移至接种室超净工作台继续操作，在超净工作台上每去除一片叶鞘，用 75%酒精对外植体从蔗稍基部往尾部擦拭一遍直至露出茎尖端，此时，接种操作人员一手 紧握蔗稍基部，另一手用经过高温灭菌的手术刀切取茎尖端〇. 5~lcm左右的组织后接种于 外植体培养基上。
[0019] 其它步骤同常规培养。通过本发明制备所得无菌外植体体量较大，外植体褐变大 为减轻，更易于接种成活和诱导，因此更易于后续阶段的丛生芽诱导培养、增殖培养等。后 续阶段的培养可参照杨本鹏等《甘蔗健康种苗培育体系的建立》(2006年，热带作物学报，第 27卷第4期）。
[0020] 三、实施的有益效果
[0021] 表1本发明与常规外植体的制备方法效果对比表
[0022]
[0023]由表1可看出，本发明不仅省去了氯化汞消毒这一环节，还降低了外植体取材的操 作技术门槛。相比现有技术，本发明取材的外植体更有利于后续阶段的培养，也有利于培育 质量稳定的后代种苗且易于实现规模化生产。
【主权项】
1. 一种甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，其特征在于取生长健壮、无病虫为 害的植株分割成单芽段，置于52°C温汤中恒温浸泡2h后种植于无菌种源圃；5~7个月后，连 续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌操作切取茎尖端作为无菌外植体。2. 根据权利要求1所述的甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，其特征在于按以 下技术流程进行:熟期甘蔗大田-选取生长健壮、无病虫为害的植株-单芽段-52°C温汤 浸泡2h-无菌种源圃种植5~7个月-病原物检测-连续晴天3天以上，取无病原物植株甘 蔗的稍部-去除外部包裹的4~5片叶鞘后移至接种室-在超净工作台上每去除一片叶鞘， 用75%酒精对外植体基部往尾部擦拭一遍直至露出茎尖端-切取茎尖端0.5~lcm左右的 组织接种于外植体培养基上-其它步骤同常规培养。3. 根据权利要求2所述的甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，其特征在于:所述 无菌种源圃为防虫网包围在棚架结构四周形成的与外界隔绝的封闭空间。4. 根据权利要求3所述的甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，其特征在于:所述 防虫网规格为60目。5. 根据权利要求4所述的甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，其特征在于:所述 棚架结构高为4~6m，采用竹竿、塑料管或不锈钢管制作。
【专利摘要】本发明公开了一种甘蔗脱毒健康种苗无菌外植体的制备方法，取生长健壮、无病虫为害的植株分割成单芽段，置于52℃温汤中恒温浸泡2h后种植于无菌种源圃；5～7个月后，连续晴天3天以上，取无病原物植株甘蔗的稍部，采用无菌操作切取茎尖端作为无菌外植体。本发明与常规的外建方法最大的区别在于省去了氯化汞消毒步骤。本发明生态、环保且简便易行，为甘蔗脱毒健康苗规模化生产提供无菌外植体取材的好方法。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105613298
【申请号】CN201610058186
【发明人】唐利球, 马文清, 陈海生, 罗晟昇, 秦昌鲜, 韦海球, 蒋亚琴, 江清梅, 廖韦卫, 何洪良, 彭崇, 黄珍玲, 闭德金, 莫周美, 郭强
【申请人】广西南亚热带农业科学研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月28日