专利名称：一种甘蔗健康种苗高效繁育方法
技术领域：
本发明涉及作物种子工程领域，尤其是一种甘蔗健康种苗高效繁育方法。
背景技术：
甘蔗是我国重要的糖料作物，甘蔗良种对蔗糖产业的贡献率在60%以上， 甘蔗良种的迅速推广应用成为推动蔗糖产业发展的直接动力，甘蔗为无性繁育 作物，繁殖速率慢，而生产上常规栽培用种量大，亩用种量高达8000 — 10000芽， 而且甘蔗经数年种植后，易感花叶病、宿根矮化病等，造成甘蔗优良品种的种 性退化，导致甘蔗减产、品质下降等不良影响。因此，研究利用甘蔗健康种苗 作种，成为蔗糖产业可持续发展的可行途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，它能有效解决目前 甘蔗良种推广应用过程中，繁殖系数低，推广慢及甘蔗良种种性易退化的问题。 本发明通过以下技术方案实现
本发明根据甘蔗种苗特性，将温水脱毒技术和组培茎尖脱毒技术有机结合， 通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、 增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九个步骤培育出甘蔗良种健康种苗， 主要技术如下
① 种苗温水脱毒处理将甘蔗的中部芽砍为10 12cm的单芽，置于水温 52i:的恒温水浴锅中，进行30min的温水脱毒处理；
② 种苗催芽:将温水脱毒处理过的甘蔗芽，先用0.5%多菌灵浸泡5min，按 5cm的间隔距离，依次摆放于底部有2 3cm厚粗沙的不锈钢托盘中，盖上2cm 厚的粗沙，用MS培养基的无机成分溶液浇透，覆盖薄膜保水，然后置于温度35 °C、光强为2000Lx的培养箱里，每天光照培养14h，进行催芽处理，处理过程 中，间隔3天喷一次0.5%多菌灵杀菌，待蔗芽生长至15 18cm时，即可沿基 部将芽取下备用；
③ 外植体剥离接种:将步骤②中培养获得的蔗芽，剥去外层老叶，用75%的 酒精棉球进行表面消毒，放入超菌工作台上，直接剥离蔗芽茎尖生长点1 2mm 接种；
④ 诱导培养把步骤③中剥离获得的茎尖，接种培养于培养基成分为 MS+0. 5mg/L6-BA+3%Sugar+0. 7%Agar+0. 05%AC的培养瓶中，每一瓶接种一个茎 尖。接种完成后，将接有外植体的培养瓶置于温度为28 32'C、光强为2000 2500Lx的培养室内进行诱导培养；
⑤ 病毒检测诱导培养获得丛芽后，目测弃出变异苗，再以每瓶中的一个 芽丛为单位，每丛取0. 5g叶片，提取蔗叶汁，应用电镜、ELISA检测甘蔗花叶病； 应用PCR技术检测宿根矮化病，PCR检测引物为单引物组合，Lxxl: ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2 : CCGAAGTGAGCAGATTGACC或RSD33 : CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297: TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC，检测弃出病毒苗， 获得健康植株，方可进行工厂化的增殖扩繁；
⑥ 增殖扩繁在无菌条件下，将经过检测获得的健康植株，先转接于培养 基HS+lmg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中，进行适应培养一代后，再转接至培养基 HS+2mg/L6-BA+3%Sugar+0. 02%AC中培养，随后的增殖继代交替使用这两个培养 基配方，培养条件与诱导培养条件相同，即培养温度为28 32°C、光强为2000 2500Lx， 15 20天继代一次，每代增殖达3 5倍；
⑦ 生根培养将增殖培养到第7代的甘蔗丛芽，转接至生根培养基 1/2MS+4. Omg/LNM+2. 5mg/LMET+2%Sugar+0. 05%AC上，进行生根培养，培养条 件与诱导培养条件相同，即培养温度为28 32'C、光强为2000 2500Lx，培养 20 25天，即可生根长成完整植株，生根率达98%;
⑧ 驯化练苗假植移栽前，将长成完整植株的瓶盖和培养室的窗户一起打
开，进行驯化练苗2 3天，开瓶练苗时间在早晨或傍晚进行；
⑨ 室外假植甘蔗健康种苗的假植在防虫网室内进行，将驯化好的甘蔗瓶 苗，剪去枯黄叶和叶尖，自来水漂洗干净，浸泡于O. 1%的高锰酸钾溶液405， 按照6cmX8cm的株行距种植于沙床上，浇透水，搭建拱棚，盖膜并加盖遮荫网 保持温度在26 38。C、保持湿度在60 80%，假植期间每隔2天喷淋一次0. 5
%多菌灵，连续喷淋3次，防治霉菌，假植8 10天，健康植株成活转绿，喷 施0.1%的尿素，补充养分，并随着幼苗生长，将喷施浓度提高到0.2%;假植 18 22天后，甘蔗健康植株抽出大量新叶，剪叶促壮；假植25天后，植株迅速 生长，丛苗单株间相互竞争吸收营养，为使幼苗更充分的生长，将丛芽苗分为 单株进行二期假植。按照此假植管理要求操作，甘蔗健康种苗的成活率高，达 90%以上，且培育植株健壮。
本发明具有的有益效果如下
本发明采用温水脱毒和茎尖脱毒相结合，脱毒彻底、效果好；外植体无需 进行消毒，直接剥离接种，污染率低、褐化轻，容易诱导产生丛芽；繁殖系数 高、速度快、周期短；种性稳定，苗健壮；病毒检测精密准确；室外假植成活 率高，达90%以上；生产成本低、效率高、适合工厂化生产。该技术较适合甘 蔗科研单位、蔗糖行政主管部门和生产企业推广使用。
具体实施例方式
本发明提供的甘蔗健康种苗高效繁育方法，需要具备一条组培生产线和与 之相配套的育苗温室及恒温水浴锅、培养箱等简易设施，并严格按照上述发明 内容部分提供的九项技术措施操作，即可培育出甘蔗良种的健康种苗，用于甘 蔗优良品种推广。
权利要求
1.一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，其特征在于通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九个步骤培育出甘蔗良种健康种苗。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种苗温水脱毒处理步骤是将甘蔗的中部芽砍为10 12cm的单芽，置于水温52"C的恒温水浴锅中，进 行30min的温水脱毒处理。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种苗催芽步骤是将温 水脱毒处理过的甘蔗芽，先用0.5X多菌灵浸泡5min，按5cm的间隔距离，依次 摆放于底部有2 3cm厚粗沙的不锈钢托盘中，盖上2cm厚的粗沙，用MS培养 基的无机成分溶液浇透，覆盖薄膜保水，然后置于温度35'C、光强为2000Lx的 培养箱里，每天光照培养14h，进行催芽处理，处理过程中，间隔3天喷一次 0.5%多菌灵杀菌，待蔗芽生长至15 18cm时，即可沿基部将芽取下备用。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植体剥离接种步骤 是将蔗芽剥去外层老叶，用浓度75%的酒精棉球消毒后，直接剥离蔗芽茎尖生 长点1 2mm接种。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的诱导培养是将茎尖接 种培养于培养基成分为MS+O. 5mg/L6-BA+3%Sugar+0. 7%Agar+0. 05%AC的培养瓶 中，每一瓶接种一个茎尖，接种完成后，将接有外植体的培养瓶置于温度为28 32°C、光强为2000 2500Lx的培养室内进行诱导培养。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的病毒检测是将诱导培 养获得的丛芽目测弃出变异苗，再以每瓶中的一个芽丛为单位，每丛取0.5g叶 片，提取蔗叶汁，应用电镜或ELISA检测甘蔗花叶病；应用PCR技术检测宿根矮 化病，PCR检测引物为单引物组合，Lxxl: ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2: CCGAAGTGAGCAGATTGACC 或 RSD33 : CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297 : TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC,检测弃出病毒苗，获得可进行工厂化增殖扩繁的健康 植株。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的增殖培养是将经过检 测的健康植株，先转接于培养基为HS+lmg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中，进行适 应培养一代后，再转接至培养基HS+2mg/L6-BA+3%Sugar+0.02%AC中培养，随后 的增殖继代交替使用这两个培养基配方，培养温度为28 32T:、光强为2000 2500Lx; 15 20天继代一次，每代增殖达3 5倍。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生根培养是将增殖培 养到第 7代的甘蔗丛芽，转接至生根培养基 1/2MS+4. Omg/LNAA+2. 5mg/LMET+2%Sugar+0. 05%AC上，在培养温度为28 32°C、 光强为2000 2500Lx条件下进行生根培养，培养20 25天，即可生根长成完 整植株。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的驯化练苗是将长成完 整的植株的瓶盖和培养室的窗户一起打开，驯化练苗2 3天，开瓶练苗时间在 早晨或傍晚进行。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的室外假植是将驯化练 苗后的甘蔗瓶苗，漂洗干净，浸泡于O. lX的高锰酸钾溶液40s，按照6cmX8cm 的株行距种植于沙床上，浇透水，搭建拱棚，盖膜并加盖遮荫网保持温度在26 38"、保持湿度在60 80%，假植期间每隔2天喷淋一次0. 5%多菌灵，假植8 IO天后，喷施O. 1 0.2%的尿素；假植18 22天后，剪叶促壮；假植25天后， 将丛芽苗分为单株进行二期假植。
全文摘要
一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，该方法针对甘蔗为无性繁殖作物，繁殖系数低，甘蔗种植用种量大，且经数年种植后，甘蔗易感病，导致种性退化、大量减产和品质下降等问题而提出，通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九项步骤培育出甘蔗良种健康种苗；本发明采用温水脱毒和茎尖脱毒相结合，脱毒彻底、效果好；外植体直接剥离接种，无需进行消毒处理，污染率低、褐化轻，容易诱导产生丛芽；繁殖系数高、速度快、周期短；种性稳定，苗壮；病毒检测精密准确；室外假植成活率高，达90％以上；生产成本低、效率高，适合工厂化生产。
文档编号C12Q1/70GK101361458SQ20081005899
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月27日 优先权日2008年9月27日
发明者侯朝祥, 吴才文, 尹兴祥, 杰 崔, 艳 毕, 王炎炎, 俊 赵, 赵培方, 陈学宽 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所