专利名称：甘蔗宿根矮化病菌的pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产技术领域，尤其是甘蔗宿根矮化病病菌的检测技术。
背景技术：
甘蔗(5^cc力ar"瓜s。p)是我国主要的糖料作物及具有良好发展前景的生物质能作物。 甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease, RSD)是一种世界性的重要甘蔗病害，也是 我国蔗区的一种主要甘蔗病害，对甘蔗产量影响较大， 一般新植蔗产量损失10% 15%，宿 根蔗产量损失20% 25%，'且影响宿根蔗年限，是甘蔗品种退化的重要原因之一。甘蔗RSD 病原细菌寄居于蔗茎维管束中，尚无有效的化学防治方法；同时由于缺乏抗源材料，甘蔗 RSD抗病育种成效不大，至今未育成抗性较好的生产品种，目前有效的控制措施是种植健 康种苗。培育甘蔗健康种苗的主要目的是去除以甘蔗RSD病菌为主的种苗传播病害。如何 快速准确的鉴定甘蔗是否含有RSD病菌是甘蔗健康种苗生产的关键技术之一。也是甘蔗健 康种苗能否推广的保障。因此，生产上迫切需要一种能高效精确检测RSD病菌的实用技术。
RSD的鉴定方法，经历过内部症状观察一相差显微镜一免疫学(DB-EIA) —PCR检测 过程。内部症状观察早期不易发现，可靠性差；相差显微镜灵敏度较低；免疫学(DB-EIA) 有假阳性，准确性不高、灵敏度低。近年来各地有用PCR技术检测，普遍认为RCR技术提 高了检测灵敏度。但是该技术还不够成熟，尤其检测结果的重复性和稳定性差，在生产上 不实用。基于上述方法存在不足，本发明自行设计引物，优化了蔗汁前期处理，去处杂质 干扰，提高了RSD菌的DNA质量。使得PCR过程不受干扰，检测重复性稳定性达99% 。
发明内容
本发明的目的是提出一种甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法,其能快速检测甘蔗 是否含有宿根矮化病菌，具有快速、经济、准确、且可规模化大量检测的特点。
本发明的技术方案如下
本发明设计的进行PCR检测的特异PCR引物为
上5， -AAAAGGTCCAGAGGATTCGGTTC-3'
下5， -GTTTTCAACGCAGAGATTGTCCA-3'
PCR产物约256bp 甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括如下歩骤 步骤一、取甘蔗汁； 步骤二、蔗汁预处理；步骤三、改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA;
步骤四、PCR扩增；
步骤五、电泳检测。
其特征在于步骤五的电泳检测是将步骤四的PCR扩增产物经过5%聚丙烯酰胺凝胶 电泳后于0.1%的硝酸银液中染色10分钟，用双蒸水清洗1一2次，然后再于显色液(1.5 %NaOH， 0.15%甲醛，)显色，后观测结果。
与现有技术对比，本发明有如下突出特点和显著进步
一、 检测快速、结果稳定。
从大田取蔗汁起到得出检测结果只需8小时，而DB-EIA检测技术需16—20小时。且 检测结果稳定，已有PCR技术检测结果不稳定，难以在生产上应用。
二、 可以大批量检测。
本发明仅需1 2mL甘蔗蔗汁，蔗汁采集方便不需特殊设备。本发明操作简单，可以 进行批量化检测。 一个熟练的技术人员每天可以检测800个以上样品，而DB-EIA技术只 可检测200个左右样品。
三、 检测结果准确、灵敏度高。 由于本发明在蔗汁前处理中能有效去除甘蔗蔗汁中蔗蜡等次生物质对RSD的DNA影
响，获取DNA纯度高，PCR过程干扰较小，故RSD的电泳结果准确可靠。本发明使用了聚
丙烯酰胺凝胶代替了琼脂糖凝胶电泳检测，提高了检测的灵敏度。
图1为本发明的实施例电泳结果图。
具体实施例方式
实施例，
甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括如下步骤-
步骤一、取甘蔗汁随机在试验田中取甘蔗若干段，各挤压取1 2mL甘蔗蔗汁保存 于-2(TC;
步骤二、蔗汁预处理分别通过12000rpm， 4°C，离心5min;去掉蔗汁上清，留沉淀； 步骤三、通过改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA;具体步骤如下
1) 过步骤二预处理后的蔗汁沉淀加入lmL65r预热的3n/。CTAB、10 yL蛋白酶 K提取液后充分混匀；
2) 65'C保温40—60分钟，其间多次摇匀；3) 加入等体积的氯仿异戊醇(24: 1)混合液，轻轻混匀，8000rpm， 4'C，离心 10min;
4) 小心吸取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇(24: 1 )混合液，轻轻混匀，8000rpm， 4°C，离心10min;
5) 小心吸取上清液，加入2/3体积异丙醇沉淀DNA， -20°C， 30min;
6) 收集DNA (12000rpm， 4°C，离心10min)，用70%乙醇洗涤所收集的DNA ， 2—3次，风干，溶于50uL0.1xTE中，一2(TC保存备用。
步骤四、PCR扩增 在本实施例中，用于甘蔗RSD病菌检测的引物为
上游引物5'-AAAAGGTCCAGAGGATTCGGTTC-3' 下游引物5，-GTTTTCAACGCAGAGATTGTCCA-3，
反应体系总体积20pL
ddH2012.8 (iL
10xPCR buffer (含Mg2十)2.0 nL
dNTPs(2 .5mmol/L)2.0 &
Lxxl(15pm/(iL)1.0 |iL
Lxx2(15pm/|oL)1.0 pL
DNA模板lpL
Taq酶(5U L)0.20 pL
反应程序
94°C 10min; 94°C 30"—55°C 40'—72°C lmin (35个循环);72°C lOmin; 4°C， Hold。 步骤五、丙烯酰胺凝胶电泳检测；
将步骤四的PCR产物经过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后于0.1%的硝酸银液中染色10分 钟，用双蒸水清洗1—2次，然后再于显色液(1.5%NaOH， 0.15%甲醛，)显色，后观测结果。
检测结果(参见图1)， RSD病菌为256bp条带显示1、 3、 4、 5、 6、 8、 10、 12、 13、 14为阳性(样品蔗汁中含有RSD病菌)，2、 7、 9、 11为阴性(样品蔗汁中未检测到RSD 病菌)。
权利要求
1.甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括如下步骤步骤一、取甘蔗汁随机在大田中取一段甘蔗，挤压取1～2mL甘蔗蔗汁保存；步骤二、蔗汁预处理高速离心去掉蔗汁上清，留沉淀；步骤三、改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA；步骤四、PCR扩增；步骤五、电泳检测；其特征在于步骤四中进行PCR检测的特异PCR引物为上游引物5’-AAAAGGTCCAGAGGATTCGGTTC-3’下游引物5’-GTTTTCAACGCAGAGATTGTCCA-3’步骤五的电泳检测是将步骤四的PCR产物经过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后于0.1％的硝酸银液中染色10分钟，用双蒸水清洗1-2次，然后再于显色液(1.5％NaOH，0.15％甲醛，)显色，后观测结果。
2. 如权利要求1所述的快速检测甘蔗宿根矮化病菌的PCR方法，其特征在于步骤三包括如下步骤1) 经过步骤二预处理后的蔗汁沉淀加入1 mL 65'C预热的3% CTAB、 10 U L蛋白酶K提取液后充分混匀；2) 65r保温40—60分钟，其间多次摇匀；3) 加入等体积的氯仿异戊醇(24: 1)混合液，轻轻混匀，8000rpm， 4'C，离心10min;4) 小心吸取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇(24: 1)混合液，轻轻混匀，8000rpm，4°C，离心10min;5) 小心吸取上清液，加入2/3体积异丙醇沉淀DNA， -20°C， 30min;6) 收集DNA (12000rpm， 4'C，离心10min)，用70%乙醇洗涤所收集的DNA ， 2一3次，风干，溶于50uL0.1xTE中，一20。C保存。
全文摘要
本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产技术领域，提出一种甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法，包括取甘蔗汁、蔗汁预处理、改良优化CTAB法提取RSD的基因组DNA、PCR扩增、电泳检测等步骤，其中电泳检测是将PCR扩增步骤的PCR产物经过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后于0.1％的硝酸银液中染色10分钟，用双蒸水清洗1-2次，然后再于显色液(1.5％NaOH，0.15％甲醛，)显色，后观测结果。本发明有如下突出特点和显著进步1.检测快速、结果稳定，从大田取蔗汁起到得出检测结果只需8小时，且检测结果稳定。2.可以大批量检测，本发明仅需1～2mL甘蔗蔗汁，蔗汁采集方便不需要特殊设备，操作简单，可以进行批量化检测，一个熟练的技术人员每天可以检测800个以上样品。3.检测结果准确、灵敏度高，本发明在蔗汁前处理中能有效去除甘蔗蔗汁中蔗蜡等次生物质对RSD的DNA影响，获取DNA纯度高，PCR过程干扰较小，RSD的电泳结果准确可靠、灵敏度高。
文档编号C12R1/01GK101603082SQ20091003872
公开日2009年12月16日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者睿 刘, 沈万宽, 邓海华, 陈仲华, 陈健文 申请人:广州甘蔗糖业研究所